细胞分裂是细菌生长繁殖中最基本的生命过程,多数以二分裂的方式进行,需要多种蛋白质分子参与。细菌细胞分裂蛋白质机器可能成为新的抗菌药物靶标,它们的结构及调控细胞分裂的分子机制成为生命科学领域的研究热点之一,并在杆菌的研究中取得快速进展。球菌（包括椭球菌）的细胞分裂机制在很多方面不同于杆菌。譬如,在大多数杆菌中,细胞分裂机器（包括Z环和隔膜）在细胞内的正确定位是由Min系统和核酸阻抑系统控制的,这两个系统可以防止Z环在细胞赤道以外的其他任何地方组装。然而,这一系统在球菌中是缺失的。球菌的Z环和隔膜定位机制仍然是一个谜。近年来,在链球菌、乳球菌和肠球菌中发现了一种锚固蛋白Z（Mid-cell-anchored protein Z,MapZ）。目前在肺炎链球菌中的研究认为,MapZ是一种可被磷酸化的支架蛋白,在FtsZ之前到达未来的细胞分裂位点,在细胞赤道上形成环形结构,随外周肽聚糖的合成被分裂成两个环;这两个环被新生肽聚糖推向未来子细胞的赤道;MapZ通过与FtsZ互作来定位Z环和隔膜（Fleurie et al.,2014）。这种新的Z环和隔膜定位机制在球菌中是否保守?MapZ蛋白的不同结构域和磷酸化状态是否影响其功能?本研究以人兽共患的猪链球菌为研究材料,探讨了MapZ对猪链球菌生长和细胞分裂的调控作用及MapZ磷酸化对其功能的影响。1.MapZ对猪链球菌生长和细胞分裂的调控作用为了研究MapZ对猪链球菌生长和细胞分裂的影响,我们构建了猪链球菌SC-19菌株的mapZ基因缺失菌株（ΔmapZ）和回补菌株。表型比较发现,ΔmapZ菌株生长变慢,毒力降低,形态异常,细胞变短变圆,细胞粘连在一起,在扫描电镜下观察形似一串葡萄。透射电镜观察发现,ΔmapZ的隔膜定位异常,随机出现在细菌的任何位置,使细胞失去几何对称性,出现一大一小的子细胞,甚至一个分裂中的细胞出现多个隔膜。肽聚糖染色和膜染色及SIM超分辨显微镜观察发现,ΔmapZ细胞分裂过程中隔膜随机定位,导致子细胞形态异常,而且一个细胞出现不止一个分裂位点,导致子细胞不能正常分离,细菌链变长。这些结果表明,与在肺炎链球菌相似,MapZ参与猪链球菌的隔膜正确定位。为了观察MapZ在猪链球菌细胞中的定位,我们将表达GFP-MapZ的质粒转化SC-19菌株,SIM显微镜观察发现,MapZ定位在新生细胞的赤道;在分裂早期,MapZ始终定位于隔膜,随着隔膜内陷完成,MapZ出现在未来子细胞的分裂位点。与肺炎链球菌中MapZ定位不相同的是,MapZ定位于细胞赤道时,先定位于外周形成环状,随后集中分布于整个隔膜形成“饼状”,这种差异可能是由于猪链球菌隔膜分裂机制与肺炎链球菌不同所致;MapZ在猪链球菌的隔膜上富集,在细胞收缩信号出现时在新生子细胞的赤道上重新定位。MapZ是一种单次跨膜蛋白,由胞内氨基端结构域、跨膜结构域和胞外羧基端结构域组成。为了研究其胞外和胞内结构域的功能,我们分别构建了两个结构域的基因缺失菌株MapZΔextra和MapZΔcyto,都表现出与ΔmapZ相似的生长缺陷和形态异常,说明这两个结构域对MapZ的功能都很重要。我们将胞内结构域进行分段缺失,发现氨基端的前两个亚结构域（MapZ-cyto1、MapZ-cyto2）对MapZ很重要,而第三个亚结构域（MapZ-cyto3）对MapZ的功能影响较小。2.MapZ蛋白磷酸化对其功能的影响实验室前期磷酸化蛋白质组学数据发现,猪链球菌的MapZ可能被其丝氨酸/苏氨酸激酶（STK）磷酸化。我们用体外磷酸化实验证实了MapZ的确可以被STK磷酸化,并通过点突变和磷酸化实验确定了MapZ的磷酸化位点:26T和66T。为了研究MapZ蛋白磷酸化对其功能的影响,我们分别构建了6个磷酸化位点突变菌株,包括三个模拟过度磷酸化状态的菌株（MapZ-26E、MapZ-66E、MapZ-2TE）和三个模拟非磷酸化状态的菌株（MapZ-26A、MapZ-66A、MapZ-2TA）。肽聚糖染色和膜染色及SIM显微镜观察发现,这两类点突变菌株都出现与ΔmapZ菌株不完全一样的形态异常,主要表现为细菌不对称分裂,细胞膨大或者缩小;细菌的长宽比例失衡,但是隔膜定位正常。说明MapZ的磷酸化状态会影响其功能。3.MapZ与其它细胞分裂蛋白的相互作用很多细胞分裂蛋白都是通过相互作用形成蛋白复合体来发挥其作用。为了研究MapZ与哪些细胞分裂蛋白互作来影响其自身定位和功能,我们首先用pull-down和细菌双杂交筛选到FtsZ、STK、GpsB、EzrA等MapZ的互作蛋白。分别以MapZ-cyto1+2、2+3、1+3和MapZ-extra为诱饵蛋白,利用细菌双杂交来检测MapZ的结构域改变是否影响MapZ与其他重要分裂蛋白的互作。结果发现,缺失胞内结构域的MapZ不再能与STK、GpsB、EzrA等蛋白互作,表明MapZ的胞内结构域与这些细胞分裂蛋白发生相互作用。分别以MapZ-2TA和MapZ-2TE为诱饵,利用细菌双杂交来检测MapZ的磷酸化状态改变是否影响MapZ与其他重要分裂蛋白的互作。结果显示MapZ、MapZ-2TA、MapZ-2TE与STK、GpsB、EzrA等分裂蛋白的互作强度没有明显差异。MapZ的磷酸化可能只是在一定的时间和空间影响细菌的细胞分裂,这个过程很难被细菌双杂交捕捉到。我们观察了MapZ、FtsZ、STK、GpsB、MreC、PBP2X和PBP2B在ΔmapZ菌株中的定位,结果发现,这些重要细胞分裂蛋白在ΔmapZ菌株中经常错误定位。进一步观察了MapZ和FtsZ在MapZ-2TA和MapZ-2TE菌株中定位,结果发现,在形态正常的MapZ-2TA和MapZ-2TE细胞中,MapZ和FtsZ定位无异常;在某些形态异常的MapZ-2TA和MapZ-2TE细胞中,MapZ和FtsZ定位异常,FtsZ-GFP在非典型位置形成簇。进一步提示MapZ磷酸化可能具有时空调节效应。反过来,我们观察了MapZ在Δstk、ΔgpsB和ΔezrA菌株中的定位,也发现了MapZ失去了正常定位,暗示MapZ的定位和功能受其他蛋白的调控。