研究目的近年来随着临床对骨植入材料需求的日益增多和自体取骨副作用的凸现，开发具有自然骨相似性能的人工骨替代材料已经变得日益紧迫。目前，国际上关于骨替代材料研究主要集中在以生物陶瓷为代表的无机生物材料（羟基磷灰石、磷酸三钙、生物玻璃）、高分子材料（胶原和高分子化合物）以及羟基磷灰石/胶原复合材料三个方面。羟基磷灰石和磷酸钙类无机生物陶瓷具有和正常人体骨组织相似的钙、磷组成、良好的生物相容性、骨诱导活性和可降解性而成为研究的热点之一，但生物陶瓷具有脆性大，韧性弱，弹性模量高等缺点；而单纯的胶原和有机高分子生物材料虽具有较高的韧性，但力学强度较差，难以满足骨重建的要求；通过材料改性、结构设计和界面特性研究，发展无机/有机复合生物材料是解决目前生物材料性能难以满足临床实际应用中存在问题的有效途径之一，因此开展集组织结构和功能一体化的纳米羟基磷灰石（nHA）/胶原/高分子复合材料的研究已成为当前人工骨替代材料研究的热点和焦点。通过对成骨机理的深入研究，人们已经认识到自然骨微观组成是由纳米羟基磷灰石晶须和I型胶原纤维通过特定的排列和化学键的连接组成基元单位的集合。目前，在实验室已经可以合成出微观结构与自然骨（无机/有机相）组成相似的纳米羟基磷灰石/胶原(nHA/COL)颗粒，实现纳米羟基磷灰石和胶原纤维在三维空间上的有序构造，而这种三维空间的有序构造恰是自然骨生物力学特性的基础。虽然微颗粒中的纳米羟基磷灰石晶须和胶原在组成上与自然骨具有相似性，但由于其不具备宏观上的形态和功能，尚不能作为临床上的功能骨使用。其主要缺点在于降解替代性较差、无承重功能、不能用于功能重建、人工骨的形状和内部结构无法控制、无法根据需要成型、难以用于范围较大且需一定形状的骨缺损修复等。综上所述，本课题拟通过CT扫描采集自然骨结构数据，采用快速成型技术（RapidPrototyping RP）技术实现从设计到制造的自动化和可控化，进而实现从纳米羟基磷灰石/I型胶原微颗粒基元单位合成到仿生人工骨的制备一体化和系统化，克服传统人工骨制备方法上存在的缺点，以求人工骨在材料组成比例、孔隙率、外形、生物力学等方面性质与自然骨相似，真正实现人工骨材料的仿生化制备。研究方法实验第一部分纳米羟基磷灰石/胶原复合物的制备、表征及生物学性能研究。采用CaCl2溶液、NaH2PO4溶液及NaOH溶液通过自组装法制备nHA/COL复合材料。透射电镜（TEM）观察nHA/COL复合材料晶粒尺寸和微观结构。X射线粉末衍生仪（XRD）对nHA/COL复合材料的物相和结晶度进行分析，并与nHA，天然骨进行对比分析。傅里叶红外光谱仪（FTIR）对nHA/COL复合材料进行红外光谱分析，并与胶原，nHA及天然骨的红外光谱进行对比分析。采用MTT法用小鼠MC3T3-E1细胞对nHA/COL复合材料的细胞学毒性进行评价。实验第二部分三维仿生人工骨支架材料的制备及其性能研究。以聚己内酯（PCL）为粘合剂，nHA/COL粉末为原料，按照7:3的质量比预混合后，获得nHA/COL/PCL复合材料。CT扫描山羊股骨，Mimic软件三维重建后获得三维电子模型。利用熔融沉积成型设备（FDM)以nHA/COL/PCL复合材料为原料，在三维电子模型数据的控制下制得三维仿生人工骨支架。制备完成后扫描电镜（SEM）观察三维仿生人工骨支架的表明形貌及微观结构。三维仿生人工骨支架制备完毕后采用液体位移法测定人工骨支架的孔隙率。万能力学机对三维仿生人工骨支架的力学性能进行分析，计算其最大抗压强度和弹性模量，并与BAM人工骨进行对比分析。采用CCK-8法检测三维仿生人工骨支架对小鼠MC3T3-E1细胞增殖能力的影响。实验第三部分三维仿生人工骨支架修复山羊股骨大段骨缺损的实验研究。行外科手术在山羊股骨造一长度为1.5cm，保留半侧皮质的骨缺损，在实验组植入三维仿生人工骨，对照组植入BAM人工骨。术后4周、12周行影像学观察，处死动物后行大体观察和组织学观察。研究结果实验第一部分通过对nHA/COL复合物的理化特性进行分析可以看出，胶原的加入使nHA晶粒的形状由原来的棒状变为针状，长度增长，宽度变窄，长径比明显增大，但晶粒尺寸仍在纳米尺度范围内；nHA晶粒呈现出密集交错的层片状分布。上述现象是由于在矿化组织中规整的结构都是源于生物大分子的规整的自组装，胶原蛋白作为模板控制nHA的结晶、生长、尺寸和形貌。nHA/COL复合物的XRD分析可见胶原的加入并未改变nHA的晶相，同时使得（002）晶面的衍射峰更加接近于自然骨的衍射峰，说明胶原具有诱导nHA在（002）晶面择优取向的作用，并使nHA/COL复合物在物相上更加接近于自然骨。最后对nHA/COL复合物进行了FTIR分析可以看出，在nHA/COL复合物样品中出现了nHA的特征基团OH和PO4的吸收峰以及蛋白酰胺Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的吸收峰，并且蛋白酰胺的三个吸收峰都发生了向高波位的红移现象，说明胶原与HA发生了吸附并产生了分子链之间的化学键合而不是单纯的物理混合。采用MTT法对nHA/COL复合物的细胞毒性进行测试，复合物的细胞毒性为0-1级。可能是由于自组装法在制备复合物过程中的分离提纯不够完全，以及所购买的胶原蛋白掺杂有杂质。但尽管如此，复合物的细胞毒性仍然符合ISO10993(GB/T16886)标准。从小鼠MC3T3-E1细胞在材料表面的生长情况可以看出，复合物对细胞有明显的增强粘附作用，并且不改变细胞形态，说明复合物对细胞无毒害作用，与细胞毒性试验的结果相吻合。实验第二部分利用三维快速成型技术，模拟山羊股骨的结构制备出长度1.5cm具有皮质骨、松质骨和骨髓腔结构的仿生人工骨支架，外形与山羊股骨缺损吻合。扫描电镜观察横切面和纵切面的表面形貌可见三维人工骨支架的孔径连通性较好一直贯通至支架材料的深部，且人工骨支架表明具有一定的粗糙度。孔隙率检测可以看出，其孔隙率为71.18~75.05%。对三维仿生人工骨支架的抗压强度和弹性模量的测量可见，其抗压强度为15.43MPa，介于松质骨和皮质骨强度之间，再加上其外形与骨缺损部位相吻合，利于手术移植。因此相对比与目前临床较常用的BAM人工骨更适合作为承重骨的修复材料。细胞增殖实验在各个时间点三维支架组的吸光度值（OD值）都大于对照组，但小于BAM组。说明nHA/COL的加入对三维支架的细胞增殖性能起到了促进作用，但由于三维支架的孔隙率低于BAM人工骨，其增殖作用不如BAM人工骨明显。在目前现有的技术条件和制备工艺下，很难做到孔隙率，机械强度和生物学性能兼顾。可以根据不同修复部位对支架材料性能的不同要求，来调整三维支架材料的孔隙率以满足修复不同部位的要求。实验第三部分三维仿生人工骨支架具有与骨缺损部位吻合的外形，有利于个性化的根据不同的骨缺损部位制备人工骨支架，同时也为一些结构不规则的结构部位的修复提供了可能。X线观察发现三维支架组的骨痂形态较为规则，与原缺损部位的吻合较好，是由于支架的三维形态为骨痂的塑形提供了模板作用。三维仿生支架可以基本满足承重骨修复的需求，并在修复精细结构的骨缺损方面具有较大的优势。组织学切片证实了三维支架对骨修复具有促进作用。在实验组切片中可见明显的骨小梁和哈弗管结构，说明三维支架修复骨缺损形成的新骨与自然骨具有相似的微观结构。结论采用自组装法合成的nHA/COL复合物微观结构与自然骨相似，胶原与nHA之间产生了化学键合，晶粒尺度在纳米范围内，无细胞毒性，细胞在其表面生长状态良好。三维快速成型技术制备的三维仿生人工骨支架材料，是具有皮质骨、松质骨和骨髓腔结构的仿生人工骨支架，外形与山羊股骨缺损吻合，并具有良好的孔径连通性，三维仿生人工骨支架的孔隙率及机械性能良好，生物学性能优良，安全无毒。进一步的动物实验成功修复了山羊股骨骨缺损，并在手术移植，骨痂的塑形，与成骨结构方面具有优势。综上所述，采用nHA/COL为基元通过快速成型技术制备的三维仿生人工骨支架，是一种在微观和宏观结构上接近自然骨，机械性能，生物学性能优良的仿生人工骨支架，具有临床运用的巨大潜力。