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乙型肝炎(hepatitis B virus)是严重危害人类健康的常见病。预防和控制乙型肝炎感染最主要的措施是接种疫苗,目前广泛地采用注射疫苗,但存在成本高,贮运过程需要冷链,注射接种需要特定的卫生机构及专业医务人员等诸多问题,因此,研制经济方便的新型乙肝疫苗是全球控制乙型肝炎的现实要求。植物基因工程技术的不断成熟为新型疫苗的研究提供了新的思路。转基因植物产生的疫苗,可由人体简单摄食含该种疫苗的植物组织,通过刺激机体粘膜的特异性免疫应答,使人体获得较持久的疾病防御能力。由于成本低廉、无需冷藏、无需一次性针头、使用方便,因此,“植物口服疫苗”得到了世界卫生组织(WHO)的提倡,开展这方面的研究对推动全球免疫计划的实施具有重要的意义。根据目前国内外的转基因植物作为疫苗生产系统的研究中发现,抗原基因的表达量较低,导致转基因植物口服疫苗的免疫原性低,可能引起免疫耐受等诸多问题,抗原表达量不高已成为目前转基因植物口服疫苗不能产业化的瓶颈,因此需要进一步提高抗原表达量。有研究表明利用组织特异性启动子调控基因的表达,使重组蛋白在植物中的表达具有器官或组织特异性,可大大提高外源蛋白的表达量。本研究采用巢式PCR技术从番茄基因组DNA克隆到长度1.3kp的果实特异性2A11启动子基因。序列分析表明,克隆到的基因序列2A11启动子转录起始位点上游的621bp处缺失了已报道的番茄2A11启动子基因(GenBank ID M87659,1993)序列中的“tatattgttaacttcttgttgaattaaagcaat”片段,其同源性为61%,登入GenBank,ID号为DQ453963;构建瞬时植物表达载体pCAMBIA2A11,用农杆菌EHA105或AGL-1。介导侵染番茄果实,GUS基因瞬间表达结果表明,该2A11启动子基因具有驱动GUS基因在番茄果实中特异性表达的功能。本研究将乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因插入植物双元表达载体pCAMBIA1301中,由自行克隆鉴定的番茄果实特异性2A11启动子驱动,得到植物表达载体p2A111301-HBs;及由番茄果实特异性2A11启动子和花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子双驱动,得到植物表达载体pCAM2A11-HBs。其选择性标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因,Tnos为终止子,?为增强子,以GUS基因为报告基因。建立番茄高频再生体系需要从培养基的激素配方(T1, T2, T3, T4, T5)、番茄不同外植体(子叶、下胚轴)的选择等方面进行番茄再生体系的优化。通过比较微型番茄“MICRO-TOM”子叶、胚轴和叶片对农杆菌的敏感性以及组培中的发芽率,最终选择子叶作为受体材料,其分化率和分化的不定芽的质量均明显优于胚轴和叶片。以含质粒pCAM2A11-HBs、p2A111301-HBs、及本室已构建保存的由组成型启动子CaMV35S驱动HBsAg的植物载体p1301HBs(均含有GUS基因)的根癌农杆菌侵染番茄外植体,以GUS瞬时表达效率为指标,系统研究了预培养时间、共培养条件、筛选条件等对转化率的影响的基础上建立、优化了微型番茄“Micro-tom”品种的遗传转化体系。结果表明外植体子叶预培养2d;活化后农杆菌稀释后浓度为OD6000.1,侵染5min;农杆菌侵染后暗光下共培养2d;筛选剂潮霉素(Hyg)浓度为20mg/L;在共培养基中加入100umol/L的AS,可大大提高了GUS瞬时表达率;经过脱菌处理后的材料应先恢复培养1周再加压筛选,有利于提高转化效率。将带有HBsAg-s的微型Ti质粒通过农杆菌介导分别转入微型番茄中,通过潮霉素加压筛选试验,结果选择20mg/L的潮霉素浓度作为转基因植株芽分化选择压力,选择25mg/L的潮霉素浓度作为转基因植株生根选择压力。得到转pCAM2A11-HBs番茄株系,转p2A111301-HBs,p1301-HBs的抗性愈伤刚刚开始分化抗性芽。获得的转化植株经GUS报告基因检测及PCR、Southern杂交检测,证实目的基因已整合到微型番茄“Micro-tom”的基因组中。ELISA检测结果表明在转基因番茄叶片中表达的HBsAg具有免疫活性,测得其表达量为385～891ng/g鲜重,占总可溶性蛋白(TSP)的0.0032～0.007%。由于时间关系,还不能检测转基因番茄果实中表达的HBsAg的免疫活性及表达量。目前已种植的转HBsAg基因植株35株。小番茄(Cherrytomato)是近年来新兴的小型蔬果,其营养价值高,可食性好、被普遍作为生食水果,微型番茄“Micro-tom”体型小,生长周期短,一年可种四代,具有发展为口服疫苗的良好潜力。本研究采用自行克隆鉴定的番茄果实特异性2A11启动子,以及用2A11-CaMV35S双启动子,驱动乙型肝炎病毒表面抗原小蛋白(HBsAg-s),转化微型番茄“Micro-tom”,筛选鉴定获得转基因番茄植株,期望获得较高表达量的番茄转化株系,为研制乙型肝炎转基因番茄口服疫苗,提供了一些实验、理论指导。