嗜血支原体是一种红细胞表面寄生的,能引起感染猪出现发热、贫血、母猪产仔率下降、生猪生长缓慢等临床症状为特征的病原微生物,造成养殖业重大经济损失。由于该病人兽共患的特点,其公共卫生安全重要性也日益凸显。但迄今为止,受嗜血支原体无法体外培养等技术瓶颈制约,该病原的研究进展十分缓慢。在基因组测序、重要蛋白分子鉴定、致病力评估、有效药物开发、疫苗研制及宿主病原互作机制等方面的研究工作尚处于起步阶段。本文主要从以下五个方面对该病原进行了研究。一、病原学特性-猪嗜血支原体形态学观察本研究通过透射及场发射扫描电镜技术观察嗜血支原体形态结构。发现嗜血支原体直径在0.2～1μm左右,透射电镜观察发现嗜血支原体与红细胞的间隔区达到50nm。间隔区可见纤丝样结构。场发射扫描电镜观察发现在经解离处理的红细胞表面有大量空洞,疑为嗜血支原体纤丝样结构嵌入到红细胞内部后产生,这些空洞改变了红细胞内外渗透压环境,导致红细胞变形和破裂。这可能是嗜血支原体感染引起免疫性溶血外的另一种结构破坏性溶血机制。本研究证实在Tween-20及3% EDTA处理下再经过52℃水浴方法可有效的将嗜血支原体脱离至血浆中,为该病原的分离纯化提供依据,为后续研究工作奠定了基础。二、病原学特性-嗜血支原体霰弹蛋白组学研究本研究通过一维电泳初步分离猪嗜血支原体总蛋白,然后分成4部分进行串联质谱分析,以降低高丰度蛋白对低丰度蛋白鉴定的抑制作用。由于猪嗜血支原体尚未进行基因组测序,我们选择了与其进化关系接近及分类上尚有争论的支原体及立克次氏体蛋白数据库进行比对。结果鉴定了分别与支原体和立克次氏体同源蛋白487和492个。根据分子生物学功能这些蛋白分为八大类。将鉴定到的全部蛋白质序列与KEGG数据库进行比对分析,鉴定了大部分参与糖代谢及核苷酸生物合成的必需酶,相关膜表面物质运载体及部分参与其它物质代谢或合成的酶类,发现猪嗜血支原体自身合成营养物质的能力有限,需从外界吸取营养物质以满足病原增殖需求。同时鉴定了部分具有免疫原性蛋白、相关药靶分子及耐药基因,为后续猪嗜血支原体病的药物治疗及疫苗开发等奠定基础。三、宿主互作机制-鉴定红细胞表面带3蛋白为嗜血支原体结合蛋白的研究本研究首次对猪嗜血支原体宿主病原互作机制进行初步分析。通过对嗜血支原体进行严格的分离纯化,密度梯度离心方法获得其细胞膜组分。对嗜血支原体膜蛋白进行荧光及生物素标记,通过体外结合实验分析其与不同酶处理红细胞的结合能力。结果发现嗜血支原体是通过红细胞表面一种胰蛋白酶及糜蛋白酶敏感但神经氨酸酶耐受的分子完成结合的。随后免疫共沉淀与串联质谱实验鉴定该蛋白为红细胞膜带3蛋白。体内感染阻断实验验证了带3蛋白介导嗜血支原体与红细胞的粘附。该研究成果对猪嗜血支原体感染机制,跨种间传播研究及药物疫苗开发具有重要意义。四、流行特点-鉴定猪嗜血支原体特异性1.8Kb EcoRI DNA片段为猪基因组序列的研究通过非血源性DNA样品PCR对照及染色体步移等方法,发现2003年瑞士苏黎世大学发表的一段猪嗜血支原体1.8Kb EcoRI DNA序列为猪基因组序列。该DNA片段与猪第14号染色体的重叠区(Contig NW001885442)同源性达到99%,在其侧翼序列存在一个猪特异性重复序列。结果证实该片段来源于猪基因组而非猪嗜血支原体。由于该序列发表于2003年,国际上许多研究小组已采用该基因进行猪嗜血支原体的检测。因此本研究结果及时更正了该病在分子生物学检测的误区,对于建立准确的诊断方法具有重要意义。五、流行特点-上海地区规模化养殖场嗜血支原体流行情况调查由于前期本研究室也采用了瑞士苏黎世大学发表的DNA片段进行了猪嗜血支原体病在上海猪场流行情况的调查,所以本研究采用16S rRNA基因做为检测靶分子,重新分析这些上海地区猪群的感染情况。结果发现86%的猪感染有猪嗜血支原体,且半数以上动物表现不同程度的发病症状。同时发现这些猪场49.2%的饲养人员及兽医感染嗜血支原体,经同源性比对发现分离自猪和人体内的嗜血支原体均为猪嗜血支原体,提示存在动物-人跨种间传播。大部分感染猪有皮下毛囊出血现象,统计学分析其与嗜血支原体感染存在相关性。本研究结果证实猪嗜血支原体在上海地区广泛流行,并存在跨种间传播感染,为今后该病大规模流行病学调查积累了第一手资料。