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胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种重要的肠促胰素,主要由肠道L细胞合成并分泌,葡萄糖依赖性促进胰岛β细胞分泌胰岛素,抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素。除降糖作用外,GLP-1通过影响迷走神经传入纤维和下丘脑,抑制食欲并延缓胃排空,从而减轻体重。GLP-1通过与GLP-1受体(GLP-1 receptor,GLP-1R)结合发挥作用。在生理状态下,循环中的GLP-1被二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)迅速降解。利拉鲁肽是GLP-1受体激动剂(GLP-1 receptor agonists,GLP-1RA)的代表药物之一,与内源性GLP-1结构具有97%同源性,能有效抵抗DPP-IV的降解,且具有更长的半衰期,目前被认为是治疗2型糖尿病强有力的药物选择。糖尿病是椎间盘退变的潜在病因之一。糖尿病患者椎间盘退变的发病率高于非糖尿病患者。高糖对椎间盘细胞的生物学产生负面影响,诱导椎间盘细胞衰老和凋亡。由于两者之间的相关性,降糖药物对椎间盘退变的影响受到越来越多的关注。除了对血糖控制有益之外,利拉鲁肽在多种组织中发挥调节细胞增殖、分化和凋亡的功能。然而,关于利拉鲁肽对髓核细胞(nuclear pulposus cells,NPCs)的影响研究甚少。在体外研究部分,本研究探讨利拉鲁肽对人NPCs凋亡的影响及其潜在机制,为临床糖尿病椎肩盘退变患者提供新的治疗策略。血糖变异性也称血糖波动(glycemic variability,GV),为葡萄糖在高(峰值)和低(谷值)水平之间波动的程度,通常随着2型糖尿病病程的延长,胰岛功能进行性下降,胰岛素分泌减少,GV增加。GV可能通过诱导炎症、氧化应激和内皮功能障碍与糖尿病大血管和微血管并发症的发生发展有关。扫描式葡萄糖监测(flash glucose monitoring,FGM)系统可以连续提供14天的动态葡萄血糖图谱,为评估血糖和GV提供了新方法,有利于指导临床用药。在临床研究中,本研究对血糖控制欠佳的2型糖尿病患者短期给予利拉鲁肽联合持续皮下胰岛素输注(continuous subcutaneous insulin infusion,CSII)治疗,应用FGM获取14天内多个时间点的血糖动态曲线,测量基线和研究终点时血清氧化应激及脂肪因子等的水平,以评估利拉鲁肽与CSII短期联合与CSII单独应用在2型糖尿病患者中的差异。第一部分利拉鲁肽抑制高糖诱导人髓核细胞凋亡目的:观察不同浓度利拉鲁肽对人NPCs凋亡的影响,并证实GLP-1R在人NPCs中的表达。方法:第三代人NPCs分为以下各组:1)对照组:人NPCs培养液培养;2)高糖组:0.2M高糖培养液培养;3)不同浓度的利拉鲁肽干预组:0.2M高糖+利拉鲁肽(10、100、1000n M)。48h干预结束后,Ed U检测细胞活性,流式细胞仪和ELISA法检测细胞凋亡,Caspase-3活性检测试剂盒检测细胞中caspase-3活性,Western blot和免疫荧光法检测人NPCs中GLP-1R表达。结果:1.Western blot分析和免疫荧光检测表明人NPCs表达GLP-1R。2.利拉鲁肽(10、100、1000n M)增加高糖环境下人NPCs的活性(P<0.05),且其浓度为10n M时即发挥了明显的保护作用,当浓度为100n M时,细胞保护作用最明显(P<0.05)。3.利拉鲁肽非剂量依赖性抑制高糖诱导的人NPCs凋亡,抑制caspase-3活性(P<0.05)。利拉鲁肽在100n M时抗凋亡作用最大(P<0.05)。结论:1.人NPCs表达GLP-1R。2.利拉鲁肽能够抑制高糖诱导的人NPCs调亡。第二部分利拉鲁肽通过激活PI3K/Akt/mTOR和PI3K/Akt/GSK3β信号通路抑制高糖诱导的人髓核细胞凋亡目的:探讨利拉鲁肽抑制高糖诱导的人NPCs凋亡的潜在分子机制。方法:人NPCs在利拉鲁肽(100n M)或联合PI3K抑制剂LY294002、mTOR抑制剂雷帕霉素或GSK3β抑制剂SB216763的高糖环境下培养48h,流式细胞术测定人NPCs ROS含量,流式细胞术和ELISA法检测细胞凋亡,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western blotting检测凋亡相关基因和蛋白表达水平,小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染沉默GLP-1R,检测Akt、caspase-3表达和人NPCs凋亡。结果:1.高糖环境下,利拉鲁肽抑制ROS生成,PI3K抑制剂LY294002部分消除利拉鲁肽的作用(P<0.05)。2.利拉鲁肽减少高糖诱导的人NPCs凋亡,促进Bcl-2基因和蛋白表达,抑制Bax以及caspase-3基因和蛋白表达(P<0.05)。PI3K抑制剂LY294002部分逆转利拉鲁肽的抗凋亡作用(P<0.05)。3.100n M利拉鲁肽诱导Akt、mTOR及GSK3β磷酸化,降低caspase-3表达,PI3K抑制剂LY294002阻断这种作用(P<0.05)。mTOR抑制剂雷帕霉素和GSK3β抑制剂SB216763分别抑制mTOR和GSK3β磷酸化,两种抑制剂组caspase-3水平均显著升高(P<0.05)。4.siRNA沉默GLP-1R后抑制利拉鲁肽干预组Akt磷酸化,增加caspase-3表达,阻断利拉鲁肽的抗凋亡作用(P<0.05)。结论:1.利拉鲁肽通过抗氧化应激及激活P13K/Akt/mTOR/caspase-3和PI3K/Akt/GSK3β/caspase-3信号通路抑制高糖诱导的人NPCs调亡。2.利拉鲁肽在高糖环境中对人NPCs的抗凋亡作用是通过GLP-1R依赖途径实现的。第三部分利拉鲁肽联合胰岛素泵对2型糖尿病患者血糖变异性影响:一项基于扫描式葡萄糖监测系统研究目的:GV可能通过诱导炎症、氧化应激和内皮功能障碍等参与糖尿病并发症的发生发展。FGM提供了一种连续监测间质葡萄糖水平长达14天的新方法。本研究应用FGM评估利拉鲁肽和CSII的短期联合应用与单独应用CSII降低GV差异。方法:选择二甲双胍和每日多次皮下注射胰岛素血糖控制欠佳的2型糖尿病患者(n=60)随机分为两组,对照(CSII)组和CSII联合利拉鲁肽(CSII+Lira)组,住院治疗14天。应用FGM评估GV、葡萄糖目标范围内时间(time in target range,TIR),同时检测基线和研究终点时体重、血清氧化应激及脂肪因子水平。结果:CSII+Lira组体重、CV显著降低,而CSII组无明显变化。平均血糖、平均血糖波动幅度、标准差、TIR(3.9-10mmol/L)和高血糖率(>10mmol/L)在两组组间的差异有统计学意义(P<0.05)。CSII+Lira组与CSII组相比,血清脂联素、血红素氧合酶-1、核因子NF-E2相关因子2水平升高,血清瘦素水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在2型糖尿病患者中,利拉鲁肽与CSII的短期联合应用在改善GV、TIR、体重、核因子NF-E2相关因子2/血红素氧合酶-1、瘦素、脂联素等心脏代谢危险标志物方面优于单独应用CSII。