背景和目的慢性阻塞性肺疾病的发生发展通常与慢性炎症、氧化应激和蛋白酶抗蛋白酶失衡等机制有关。气道上皮细胞的化生、粘液细胞增生导致粘液分泌过度是主要的慢阻肺病理改变,其具体机制尚不十分明确。既往研究发现肺泡巨噬细胞在慢阻肺发病中扮演重要角色,但其对气道上皮细胞可产生何种影响研究较少。近来外泌体及其分泌的mi RNA在细胞间通讯发挥的作用日益得到研究人员的关注。作为外泌体重要来源之一的肺泡巨噬细胞是否对气道上皮细胞发挥作用及其机制目前尚未见报道。流行病学研究表明,慢阻肺患者每年肺癌发病率较正常人群高4-5倍,提示慢阻肺与肺癌的发生关系密切。这两种疾病都涉及气道上皮细胞生物学功能和结构的改变。本研究拟通过建立慢阻肺大鼠动物模型,提取肺泡巨噬细胞与气道上皮细胞(16HBE)共培养。采用CCK8法、Transwell侵袭实验、克隆形成实验及Western Blot、Elisa等方法检测气道上皮细胞增殖活力等恶性细胞特征及相关黏蛋白和炎症介质的表达水平;运用生物信息学方法明确目标mi RNA,分离和鉴定巨噬细胞外泌体,并探索外泌体mi RNA在细胞间通讯中对气道上皮细胞的影响,并探讨其分子机制,以期揭示外泌体在巨噬细胞与气道上皮细胞通讯间发挥的桥梁作用,亦可扩展对慢阻肺与肺癌相关联机制的认识,为今后进一步寻找可能的慢阻肺治疗干预靶点,阐明慢阻肺与肺癌发生相关性并减少慢阻肺合并肺癌发生提供理论依据。材料和方法一、慢阻肺来源肺泡巨噬细胞对气道上皮细胞的作用采用香烟烟雾和脂多糖诱导的方法建立慢阻肺大鼠动物模型,HE染色观察肺组织病理改变。从肺泡灌洗液中分离巨噬细胞,将肺泡巨噬细胞与气道上皮细胞16HBE共培养,通过CCK8法、克隆形成实验和Transwell侵袭实验检测气道上皮细胞增殖活力和迁移能力;运用Western Blot和Elisa方法测定气道上皮细胞的黏蛋白以及促炎介质IL-6、TNF-α的表达水平。二、慢阻肺肺泡巨噬细胞来源的外泌体对气道上皮细胞功能的影响以试剂盒法从慢阻肺大鼠及健康对照组大鼠肺泡巨噬细胞中提取外泌体,通过电子显微镜观察外泌体形态,纳米粒径分析、Western Blot方法分析及鉴定外泌体。从GEO数据库中分析对比慢阻肺及正常人外周血差异显著的mi RNA,进而通过相应的mi RNA阵列分析检测巨噬细胞外泌体差异表达的mi RNA。在气道上皮细胞中过表达该mi RNA,通过CCK8、Transwell侵袭实验和Western Blot观察过表达mi RNA对气道上皮细胞生物学功能的影响。三、慢阻肺巨噬细胞外泌体对气道上皮细胞功能影响机制的探讨运用生物信息学方法对外泌体mi RNA进行靶基因预测,CCK8分析阻断该靶基因对气道上皮细胞增殖能力的影响。结果一、慢阻肺来源肺泡巨噬细胞对气道上皮细胞的作用1.气道上皮细胞与慢阻肺肺泡巨噬细胞共培养后,其增殖活力和迁移能力较与健康对照组肺泡巨噬细胞共培养者相比明显增强(P<0.05)。2.慢阻肺肺泡巨噬细胞促进气道上皮细胞黏蛋白MUC5AC,MUC5B及MUC2的产生,抑制CFTR的表达。3.与慢阻肺肺泡巨噬细胞共培养的气道上皮细胞分泌的肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的分泌水平较对照组显著上升(P<0.001)。二、慢阻肺肺泡巨噬细胞来源的外泌体对气道上皮细胞功能的影响1.通过Western Blot检测外泌体表面特定标志蛋白,由SBI试剂盒可成功提取外泌体,其在电镜下结构清晰可辨,可见囊泡样结构,纳米粒径分析慢阻肺组巨噬细胞外泌体中位数粒径139.6nm,浓度2.8×10~7/ml,对照组巨噬细胞外泌体中位数粒径139.8nm,浓度2.1×10~7/ml,两组外泌体粒径大小和浓度无明显差异。2.通过GEO数据库分析和mi RNA阵列分析表明mi R-380为肺泡巨噬细胞外泌体中明显上调的mi RNA。外泌体mi R-380增强气道上皮细胞16HBE的增殖活力和和迁移能力(P<0.05),促进气道上皮细胞16HBE黏蛋白MUC5AC、MUC5B和MUC2的表达,抑制CFTR的表达。三、慢阻肺巨噬细胞外泌体对气道上皮细胞功能影响机制的探讨1.运用生物信息学方法对外泌体mi R-380进行靶基因预测,mi R-380对应的靶基因为囊性纤维化跨膜传导调节因子CFTR。2在气道上皮细胞中构建CFTR-si RNA导致CFTR的低表达;阻断靶基因CFTR后,增强了气道上皮细胞16HBE的增殖活力和迁移能力(P<0.05)。结论慢阻肺肺泡巨噬细胞可增强气道上皮细胞的增殖和迁移能力,促进其黏蛋白及促炎介质白介素-6和肿瘤坏死因子-α的表达;慢阻肺肺泡巨噬细胞来源外泌体mi R-380含量明显上调,气道上皮细胞16HBE的增殖活力和和迁移能力的增强与黏蛋白的表达增加可能与外泌体向气道上皮细胞递送mi R-380,负调控CFTR基因导致CFTR蛋白下调有关。