大豆新型高效遗传转化体系的研究

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大豆是重要的经济作物,因此提高和优化大豆品质成为人们关注的热点。利用转基因技术提高大豆品质,已成为相关研究的常用方法。随着基因组学和生物信息学的快速发展以及大豆全基因组测序的完成,大豆新基因的分离和功能基因组的研究都将进一步提速。
  研究大豆的遗传转化,需要建立一个转化率高,使用方便的组培再生系统。一直以来,大豆组织再生和遗传转化难度较大,转化效率较低,转化规模较小。大豆的各种再生体系如叶片、胚轴、子叶节、子叶、胚芽尖、原生质、花粉等,均有各自的优缺点。国内外迄今尚未建立完善化、规模化、高效化的转化技术平台。
  依照前人实验结果,大豆中可能存在影响植株再生的负调控因子。本论文对大豆愈伤组织的胚状体再生途径进行了三项相对独立的实验,旨在使用新的实验方法,获得新的大豆种质资源,进一步完善大豆的遗传转化体系。
  首先,对小粒黄品种的大豆进行常压室温等离子体(ARTP)诱变,以小粒黄愈伤组织为外植体,ARTP作为诱变因素,进行离体诱变,研究了在特定诱变条件下的半致死照射量和等离子体对愈伤组织的诱变影响,并诱导恢复培养的愈伤组织产生胚状体。其次,研究了烟草WUS基因在大豆品种小粒黄中的异位表达,通过生物信息学方法在烟草中找到了与大豆GmWUS基因相似的烟草WUS基因,命名为NtWUS基因,通过PCR方法获得了该基因片段,再将其用T-A克隆的方法连接到T载体上,之后借助剪接工具酶将NtWUS基因连接到植物表达载体上,转化了大豆小粒黄的愈伤组织,并进行了GUS染色。最后探讨了2,4,5三氯苯酚代乙酸(2,4,5-T)对大豆胚状体的诱导作用,设计了较低浓度的2,4,5-T浓度梯度来诱导Williams82和小粒黄两个品种的愈伤组织形成胚状体,并统计了诱导效率。
  根据实验结果,首先,在输入功率为320w,工作气量为15SLM,等离子体发射源距待处理样品3mm的条件下,以99.99%高纯氦气作为工作气体并使用小粒黄愈伤组织作为外植体时,在300s达到了半致死剂量;此强度的ARTP照射处理小粒黄愈伤组织,确实刺激了愈伤组织向胚性愈伤组织的转变,但没有产生再生植株。其次,得到了能够稳定表达NtWUS基因的小粒黄愈伤组织,并且发现在一定范围内,转化效率随着乙酰丁香酮(AS)的浓度升高而增加,在200mMol/L的浓度下,转化率达到了88.9%。最后,通过对小粒黄品种的诱导,发现2,4,5-T在0.06mg/L及更低的浓度下会诱导根的生成,而在0.1mg/L的浓度下主要诱导愈伤组织的形成,至于0.3mg/L及更高浓度,可以用4周左右的时间诱导出胚状体,而Williams82品种的愈伤组织也可观察到近似趋势。
  本论文尝试了多种方法诱导大豆愈伤组织通过胚状体途径形成再生植株,完善了ARTP方法诱变的步骤,留下了转基因大豆材料,并探究了2,4,5-T在诱导胚状体过程中的适宜浓度,为之后的实验积累了数据。
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