β-D-葡萄糖苷酶是一种可以增加葡萄酒香气的水解酶,广泛的存在于各种植物细胞和微生物中。目前,由黑曲霉产生的β-D-葡萄糖苷酶应用较为广泛,研究较多,而对产生β-D-葡萄糖苷酶的酿酒酵母的研究较少,由于葡萄酒酿造过程中添加外来β-D-葡萄糖苷酶会导致酒体不稳定,而使用可以产生β-D-葡萄糖苷酶的酿酒酵母作为葡萄酒发酵菌,既可以完成发酵过程,又达到了增香的效果,所以对高产β-D-葡萄糖苷酶酿酒酵母的研究越来越受到人们的关注。本研究对高产β-D-葡萄糖苷酶酿酒酵母KDLYS9-16的生长、产酶、酶学特性和酿酒性能进行了研究,为今后对该菌的工业应用提供数据支持。首先,为了研究KDLYS9-16菌体生长与产酶的关系,优化得到最佳的菌体生长与产酶的条件,找到菌体生长与产酶的转换点,为今后对菌体的生长培养与产酶提供依据。采用正交优化法和数学建模法,对菌体生长与产酶培养基及生长条件、菌体生长与产酶关系和金属等因素对菌种生长和产酶的影响进行优化和研究。结果显示:KDLYS9-16酿酒酵母的菌体生长与产酶为半偶联关系,即菌体生长与产酶在特定的时间具有偶联关系;当培养基成分为1.0%酵母菌粉、2.0%蛋白胨和2.0%葡萄糖,在培养温度30℃、培养基pH 5.0和溶氧量9.365 mg/L时自选酵母的生长速度最快,菌体量最大;当培养基成分为1.0%酵母菌粉、2.0%蛋白胨、2.0%葡萄糖、NaCl含量为0.2%、KCl元素含量为1.0%、MgCl₂为0.2%、CaCl₂为0.5%和BaCl₂为0.5%,在培养温度30℃、培养基pH 5.0和溶氧量9.365 mg/L时菌体产酶量最大;Ca²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Na⁺和K⁺离子对产酶具有促进作用,其中Ca²⁺、Mg²⁺和Ba²⁺可以使产酶提高35.5%、27.2%和38.3%,促进作用较为明显,而其他的金属元素对产酶具有抑制作用,尤其在加入CO²⁺、Cu²⁺和Fe²⁺离子的KDLYS9-16酿酒酵母发酵液中并未检测到酶活力,说明这3种金属离子完全抑制了产酶;维生素C和色氨酸对产酶具有促进作用,当加入量分别为2.5%和2.0%时,促进作用较为显著。通过在延滞期（发酵开始）加入2.5%的维生素C和2.0%的色氨酸,在对数期开始（8¹0 h）加入0.2%的Na⁺、1.0%的K⁺、0.2%的Mg²⁺、0.5%的Ca²⁺和0.5%的Ba²⁺,调节培养基pH为5.0,温度30℃和溶氧量为9.365 mg/L,以达到由菌体生长转为菌体产酶,酶活力可以达到0.046818 U/mL;利用数学模型对菌体生长、产酶以及生长与产酶之间的动力学关系进行了描述,建立了彼此的动态关系模型。其次,对KDLYS9-16酿酒酵母所产β-D-葡萄糖苷酶进行了初步分离纯化,并研究了该酶的理化性质和催化特性。酶纯化采用硫酸铵初级分级纯化,然后经过Sephadex G-150凝胶柱层析分离,得到纯化后的β-D-葡萄糖苷酶,使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白分子量;采用双倒数法（L-B作图法）测定酶的动力学参数K_m和V_max值;选择含有不同化学键的反应底物,对酶的最佳水解化学键进行选择;利用Design Expert 7.0统计软件进行实验设计与数据分析,根据BoxBenhnken中心组合实验设计原理,对KDLYS9-16酿酒酵母所产β-D-葡萄糖苷酶酶反应条件进行了优化。结果显示:经过纯化后的β-D-葡萄糖苷酶相比于原发酵液,纯化了272.748倍,酶比活力为0.98462 U/mg,酶活力达到0.06529 U/mL,后经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示纯化后的酶仅有一个条带,说明分离纯化效果很好,分离的β-D-葡萄糖苷酶分子量为78 kD;KDLYS9-16酿酒酵母所产β-D-葡萄糖苷酶的动力学参数K_m=8.808038627 mmol/L,V_max=1.304971943 U/（L﹒min）;此外,KDLYS9-16酿酒酵母所产β-D-葡萄糖苷酶等电点在4.5⁴.8范围内,在-20⁴0℃范围内酶活稳定性较好,酶活力可以维持60%以上,在3⁷范围内的pH环境内保存120 min后,酶活力仍然维持在40%以上;对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（pNPG）为其最佳底物,说明KDLYS9-16酿酒酵母所产β-D-葡萄糖苷酶水解β-1,4糖苷键;当反应体系缓冲溶液pH值为5.10,反应温度为48℃,底物浓度为41.4 mmol/L,在此酶反应条件下的酶活力检测到最大0.0170033 U/mL。第三,采用商品菌为对照,以模拟葡萄汁和酿酒葡萄汁为基质,对产酶菌的发酵特性进行了研究。结果显示,当以模拟葡萄汁为发酵基质时,KDLYS9-16可以很快的适应发酵环境,发酵延滞期较短,在144 h后发酵结束,而对照菌SC和F15有8 h的适应时间,发酵缓慢,发酵周期较自选菌较长,为168 h,KDLYS9-16发酵模拟葡萄汁所产生酒精度超过12°,而对照菌SC发酵后的酒精度在11.5¹2.0°之间,低于对照菌,商品菌F15发酵产生的酒精度最低,低于11.5°;以酿酒葡萄为发酵基质,自选菌KDLYS9-16依然展现了发酵启动快、发酵迅速和发酵周期短的发酵优势,尤其在发酵沙城赤霞珠自选菌几乎没有延滞期,而对照菌SC和F15在0²4 h几乎处于适应阶段,发酵缓慢,发酵结束后,KDLYS9-16发酵原酒的酒精度明显高于对照菌,尤其昌黎美乐葡萄发酵原酒,酒精度达到13.2°,而对照菌的发酵酒酒精度仅为12¹2.5°,自选菌的糖转化酒精率高达96%,而对照菌的仅为90%左右。总体而言,由CO₂生成曲线、残糖曲线和酒精度与糖转化酒精率对比,表明自选菌KDLYS9-16酿酒酵母在发酵葡萄具有发酵启动快、发酵迅速、发酵周期短、产酒精度高和糖转化酒精率高的优势。最后,以酿酒葡萄为原料,商品菌为对照,对产酶菌进行酿酒实验来评价其酿酒产香特性,以传统酿造工艺进行葡萄发酵,发酵结束后原酒密封储存于10¹5℃环境内,待发酵结束30天后取原酒样,利用GC和GC-MS分别对葡萄酒中单萜烯类物质和总香气物质进行检测。结果显示,共13种单萜烯被检测到,经过自选菌发酵后的沙城赤霞珠和昌黎赤霞珠葡萄酒中最多检测到11种单萜烯物质,含量也分别达到了2.454和2.855 mg/L,而对照菌发酵葡萄酒中的单萜烯物质含量都在0.765¹.416 mg/L之间,总体可以看出KDLYS9-16不仅可以保持葡萄中原有的单萜烯类物质,而且还可以产生新的单萜类物质,而对照菌不仅不会产生新的单萜烯类物质,而且也难以保留葡萄原有的单萜烯类物质;自选菌KDLYS9-16发酵原酒不仅香气种类多,而且含量要明显高于对照菌发酵原酒,尤其昌黎美乐葡萄原酒中检测到37种香气物质,昌黎赤霞珠葡萄酒中香气物质含量最高,达到了98.94%,而对照菌葡萄酒中的香气物质种类一般低于30种,总含量低于都90%。总体而言,相比于对照菌,KDLYS9-16发酵葡萄酒具有产香多,单萜烯含量较高,多葡萄酒具有积极的影响。综上,自选酿酒酵母KDLYS9-16的菌体生长与产酶具有菌体生长快和产酶量高的优点,所产β-D-葡萄糖苷酶可以适应于葡萄酒酿造过程中的低温和低pH环境,具有热和酸碱稳定性好的优点,通过发酵试验可知,该菌具有发酵启动快、发酵迅速、发酵周期短、产酒精度高和糖转化酒精率高的优点,发酵葡萄酒中香气物质和单萜烯类物质的含量和种类都远远的高于对照菌,具有很明显的产香优势。综上所述,自选酿酒酵母KDLYS9-16可以用于工业推广。