真菌性角膜炎是病原菌和宿主共同作用的结果。疾病早期病原体通过侵袭力、毒力、多种酶类及黏附机制致病,感染后的进一步损伤则是由宿主过强的免疫反应所致而非病原菌。常规的抗真菌药物无法控制由于局部过度的炎症反应导致的角膜组织损伤,因此,除了抗真菌治疗外,寻找一种控制免疫反应引发的过度炎症反应的治疗靶点尤为重要。NOD1/NF-kβ信号通路在细菌、病毒、真感染菌固有免疫方面发挥重要作用。镰刀菌角膜炎是我国发病率最高的丝状真菌性角膜炎。目前,未见NOD1/NF-kβP65信号通路在镰刀菌角膜炎固有免疫应答中作用机制的相关研究报道。因此,本实验通过体外实验(第一部分及第二部分)与体内实验(第三部分及第四部分)研究NOD1/NF-kβP65信号通路在镰刀菌激活体内外固有免疫应答中的炎症调控作用。第一部分不同条件的镰刀菌孢子激活人永生化角膜上皮细胞后NOD1、RIP2、NF-kβP65的表达情况[目的]检测不同灭活温度、不同密度、不同刺激时间下,镰刀菌孢子激活人永生化角膜上皮细胞(pRSV-T)后NOD1 mRNA、RIP2 mRNA和NF-kβP65 mRNA表达变化,得出最优活化NOD1/NF-kβP65信号通路条件。[方法]茄病镰刀菌接种到沙保氏培养基,26℃培养箱培养7天,收集真菌混悬液,纱布过滤提取孢子,镰刀菌孢子在不同灭活温度(55 ℃、65 ℃、75 ℃、85℃、95℃)灭活1h、不同密度(1×103CFU/ml～l×107CFU/ml)、不同刺激时间(2h、4h、8h、12h、24h)的条件下分别刺激pRSV-T细胞后,利用RT-qPCR检测 NOD1mRNA、RIP2mRNA、NF-kβP65mRNA 的表达。[结果]1、不同灭活温度组:空白对照组、55℃组、65℃组、75℃组、85℃组、95℃组六组 NOD1mRNA 相对表达量分别为(1.00±0.00)、(1.59±0.15)、(2.21±0.2)、(1.88±0.33)、(1.51±0.25)、(1.12±0.13);RIP2mRNA 相对表达量分别为(1.000±0.00)、(1.071±0.14)、(1.91±0.22)、(1.45±0.23)、(1.23±0.12)、(1.02±0.11);NF-kβP65mRNA相对表达量分别为(1.00±0.00)、(1.27±0.14)、(2.12±0.19)、(2.21±0.25)、(1.51±0.14)、(1.09±0.18)。55℃组、65℃组、75℃组、85℃组各组NOD1mRNA 相对表达量比空白对照组升高(P<0.05),其中65℃组表达均为最高;65℃组与75℃组各组RIP2mRNA相对表达量比空白对照组升高(P<0.05),其中65℃组表达均为最高;65℃组、75℃组、85℃组各组NF-kβP65mRNA相对表达量比空白对照升高(P<0.05),其中75℃组表达均为最高。2、不同密度组:空白对照组、1×103CFU/ml、1×104CFU/ml、1×105CFU/ml、1×106CFU/ml、1×107CFU/ml六组的NOD1mRNA相对表达量分别为(1.00±0.00)、(1.08±0.13)、(1.57±0.2)、(2.06±0.15)、(1.45±0.06)、(1.04±0.09),RIP2mRNA相对表达量分别为(1.00±0.00)、(1.13±0.23)、(1.64±0.2)、(2.13±0.35)、(1.69±0.22)、(1.23±0.26);NF-kβP65mRNA相对表达量分别为(1.00±0.00)、(1.67±0.37)、(2.27±0.27)、(2.8±0.36)、(1.77±0.17)、(1.15±0.14)。1×104CFU/ml、1×105CFU/ml、1×106CFU/ml三组NOD1mRNA、RIP2mRNA相对表达量均比空白对照组升高(p<0.05);1×103CFU/ml、1×104CFU/ml、1×105CFU/ml、1×106CFU/ml 四组NF-kβP65mRNA相对表达量均比空白对照组升高(p<0.05)。其中1×105CFU/ml组、NOD1mRNA、RIP2 mRNA、NF-kβP65mRNA相对表达量最高。3、镰菌孢子(1×105CFU/ml)65℃灭活后刺激人永生化角膜上皮细胞Oh、2h、4h、8h、12h、24h 后 NOD1mRNA 相对表达量分别为(1.00±0.00)、(3.01±0.47)、(1.97±0.33)、(4.29±1.07)、(3.32±0.51)、(2.87±0.27),RIP2mRNA 相对表达量分别为(1.00±0.00)、(2.68±0.26)、(2.28±0.44)、(5.27±1.16)、(2.64±0.37)、(1.05±0.14);NF-kβP65mRNA 相对表达量分别为(1.00±0.00)、(2.81±0.29)、(1.38±0.17)、(3.27±0.51)、(1.77±0.22)、(1.47±0.23)。2h、8h、12h、24h 四组 NOD1mRNA 相对表达量均比Oh组升高(p<0.05);2h、4h、8h、12h四组RIP2mRNA相对表达量均比Oh组升高(p<0.05);2h、8h、12h三组NF-kβP65mRNA的相对表达量均比Oh组升高(p<0.05);其中刺激8h组NOD1mRNA、RIP2mRNA、NF-kβP65mRNA的相对表达量最高。[结论]不同条件的镰刀菌孢子刺激pRSV-T细胞均可导致NOD1mRNA、RIP2mRNA、NF-kβP65mRNA的表达上调;在镰刀菌孢子密度为1×105CFU/ml、灭活温度为65℃、刺激pRSV-T细胞8小时条件下,NOD1mRNA、RIP2mRNA的相对表达量最高;其余条件相同,灭活温度为75℃时NF-kβP65mRNA的相对表达量最高。第二部分NOD1/NF-kβP65信号通路在镰刀菌激活pRSV-T细胞固有免疫应答中促炎反应的机制研究[目的]验证镰刀菌孢子在激活pRSV-T细胞的固有免疫应答中,是否通过NOD1调控NF-kβP65实现对下游炎性因子(IL-6、IL-8、TNF-α)释放的调控。[方法]1.激活NOD1/NF-kβP65信号通路,分为3组:实验组(灭活的镰刀菌孢子)、对照组(NOD1特异性配体iE-DAP)、空白对照组(细胞培养基)。3组分别刺激pRSV-T细胞8h后收集细胞及上清。采用RT-qPCR及westernblot检测NOD1、RIP2、NF-kβP65的mRNA及蛋白的表达水平;免疫荧光检测NF-kβP65的表达变化;流式细胞仪检测培养上清液中炎性细胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的变化。2.NOD1抑制剂(ML130)有效浓度实验,按不同浓度0.1uM/ml、0.5 uM/ml、1 uM/ml、5 uM/ml、10 uM/ml、20 uM/ml、30 uM/ml 分别处理人永生化角膜上皮细胞24h,再加灭活镰刀菌孢子刺激8h后收集细胞,采用westernblot检测NOD1、RIP2、NF-kβP65蛋白的表达水平。3.抑制NOD1/NF-kβP65信号通路,分为3个组:实验组(灭活的镰刀菌孢子)、对照组(NOD1抑制剂ML130+灭活的镰刀菌孢子)、空白对照组(细胞培养基),实验组刺激人永生化角膜上皮细胞8h、对照组加入ML130处理细胞24h,再加灭活的镰刀菌孢子刺激8h后收集细胞及上清。采用RT-qPCR及westernblot检测NOD1、RIP2、NF-kβP65的mRNA及蛋白的表达水平;免疫荧光检测NF-kβP65的表达变化;流式细胞仪检测培养上清液中炎性细胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的变化。[结果]1.激活NOD1/NF-kβP65信号通路1.1 NOD1、RIP2、NF-kβP65转录及翻译水平表达变化如下:NOD1mRNA:Control组NOD1mRNA相对表达量为 1.00±0.00;iE-DAP组NOD1mRNA相对表达量为3.65±0.44;F.solani组相对表达量为2.95±0.36。与Control组相比,iE-DAP组及F.solani组NOD1mRNA相对表达量均增强(P<0.05);iE-DAP组及F.solani组两组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与Control组相比,iE-DAP组及F.solani组中NOD1的蛋白表达增强,表达趋势与转录水平一致。RIP2mRNA:Control组RIP2mRNA相对表达量为 1.00±0.00;iE-DAP组RIP2mRNA相对表达量为4.11±0.49;F.solani组相对表达量为3.47±0.34。与Control组相比,iE-DAP组及F.solani组RIP2mRNA相对表达量均增强(P<0.05);iE-DAP组及F.solani组两组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与Control组相比,iE-DAP组及F.solani组中RIP2的蛋白表达增强,表达趋势与转录水平一致。NF-kβP65mRNA:Control组NF-kβP65mRN相对表达量为 1.00±0.00;iE-DAP组NF-kβP65mRN相对表达量为4.60±0.26;F.solani组相对表达量为4.14±0.29。与Control组相比,iE-DAP组及F.solani组NF-kβP65mRNA相对表达量均增强(P<0.05);iE-DAP组及F.solani组两组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与Control组相比,iE-DAP组及F.solani组中NF-kβP65、P-NF-kβP65的蛋白表达增强,表达趋势与转录水平一致。1.2免疫荧光结果:NF-kβP65蛋白表达于细胞质,与Control组相比,iE-DAP组及F.solani组的NF-kβP65蛋白表达增强;活化的p-NF-kβP65蛋白表达于细胞核,与Control组相比,iE-DAP组及F.solani组的p-NF-kβP65蛋白表达增强。1.3炎性因子浓度:Control组、iE-DAP组及F.solani组pRSV-T细胞培养上清液中IL-6、IL-8、TNF-α的浓度变化如下:IL-6 浓度:Control 组 IL-6 浓度 57.50±5.21pg/ml;iE-DAP 组 IL-6 浓度331.94±42.78 pg/ml;F.solani组IL-6浓度240.94±30.15 pg/ml。与Control组相比,iE-DAP组与F.solani组IL-6浓度显著升高(P<0.05);与iE-DAP组相比,F.solani组IL-6浓度降低(P<0.05)。IL-8 浓度:Control 组 IL-8 浓度 3.58±0.42pg/ml;iE-DAP 组 IL-8 浓度16.09±2.62pg/ml;F.solani组IL-8浓度 13.03±1.54pg/ml。与Control组相比,iE-DAP组与F.solani组IL-8浓度显著升高(P<0.05);与iE-DAP组相比,F.solani组IL-8浓度降低(P>0.05)。TNF-α浓度:Control组TNF-α浓度 13.87±2.16pg/ml;iE-DAP组TNF-α浓度74.42±6.52pg/ml;F.solani组TNF-α浓度80.41±11.33pg/ml。与Control组相比,iE-DAP组与F.solani组TNF-α浓度显著升高(P<0.05);与iE-DAP组相比,F.solani组TNF-α浓度降低(P>0.05)。2.NOD1抑制剂(ML130)有效浓度检测结果:不同浓度(0.1uM/ml、0.5 uM/ml、1uM/ml、5 uM/ml、10 uM/ml、20 uM/ml、30 uM/ml)ML130 均会对 pRSV-T细胞RIP2及NF-kβP65蛋白表达产生影响。与F.solani组相比,0.1uM/ml组、5uM/ml组及20uM/ml组RIP2蛋白表达显著减弱;与F.solani组相比,0.1uM/ml组与20uM/ml组NF-kβP65蛋白表达显著减弱,其中20uM/ml组RIP2蛋白和NF-kβP65蛋白表达最少。3.抑制NOD1/NF-kβP65信号通路3.1NOD1、RIP2、NF-kβP65转录及翻译水平表达变化如下:NOD1mRNA:Control组NOD1mRNA相对表达量为 1.00±0.00;F.solani组NOD1mRNA相对表达量为3.65±0.5;ML130组相对表达量为2.91±0.26。与Control组相比,F.solani组及ML130组NOD1mRNA相对表达量均增强(P<0.05);与F.solani组相比,ML130组NOD1mRNA相对表达量降低(P>0.05)。RIP2mRNA:Control组RIP2mRNA相对表达量为 1.00±0.00;F.solani组RIP2 mRNA相对表达量为3.86±0.44;ML130组相对表达量为2.13±0.16。与Control组相比,F.solani组及ML130组RIP2mRNA相对表达量均增强(P<0.05);与F.solani组相比,ML130组RIP2mRNA相对表达量降低(P<0.05)。Westernblot结果进一步验证了 q-PCR结果。NF-kβP65mRNA:Control组NF-kβP65mRNA相对表达量为 1.00±0.00;F.solani组NF-kβP65mRNA相对表达量为3.11±0.39;ML130组相对表达量为1.67±0.18。与Control组相比,F.solani组及ML130组NF-kβP65mRNA相对表达量均增强(P<0.05);与F.solani组相比,ML130组NF-kβP65mRNA相对表达量降低(P<0.05)。Westernblot结果进一步验证了 q-PCR结果。3.2免疫荧光结果:NF-kβP65蛋白表达于细胞质,与Control组相比,F.solani组及ML130组的NF-kβP65蛋白表达均增强;与F.solani组相比,ML130组NF-kβP65蛋白表达减弱。活化的p-NF-kβP65蛋白表达于细胞核,与Control组相比,F.solani组及ML130组的p-NF-kβP65蛋白表达均增强;与F.solani组相比,ML130组p-NF-kβP65蛋白表达减弱。3.3炎性因子浓度:Control组、F.solani组及ML130组pRSV-T细胞培养上清液中IL-6、IL-8、TNF-α的浓度变化如下:IL-6 浓度:Control组IL-6浓度45.02±5.5pg/ml;F.solani组IL-6浓度314.28±33.56pg/ml;ML130组IL-6浓度 192.72±23.04pg/ml。与Control组相比,F.solani组及ML130组IL-6浓度显著升高(P<0.05);与F.solani组相比,ML130组IL-6浓度降低(P<0.05)。IL-8浓度:Control组IL-8浓度4.48±0.38pg/ml;F.solani组IL-8浓度 18.59±2.64 pg/ml;ML130组IL-8浓度8.81±1.50pg/ml。与Control组相比,F.solani组及ML130组IL-8浓度显著升高(P<0.05);与F.solani组相比,ML130组IL-8浓度降低(P<0.05)。TNF-α浓度:Control组TNF-α浓度 11.55±2.27pg/ml;F.solani组TNF-α浓度65.91±9.6pg/ml;ML130组TNF-α浓度36.85±4.89pg/ml。与Control组相比,F.solani组及ML130组TNF-α浓度显著升高(P<0.05);与F.solani组相比,ML130组TNF-α浓度降低(P<0.05)。[结论]iE-DAP与灭活的镰刀菌孢子均可使NOD1、RIP2、NF-kβP65的表达上调,使促炎因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的释放增多;NOD1抑制剂ML130可抑制由灭活镰刀菌孢子引起的RIP2、NF-kβP65的活化,使两者表达下调,并抑制促炎因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的释放。NOD1通过调控下游分子RIP2、NF-kβP65,最终调控促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α的释放,在镰刀菌孢子诱导的人永生化角膜上皮细胞免疫反应中发挥重要作用。第三部分构建树鼩茄病镰刀菌性角膜炎模型[目的]建立树鼩茄病镰刀菌性角膜炎模型,为进一步验证体内NOD1/NF-kβP65信号通路参与促炎反应提供动物模型。[方法]茄病镰刀菌接种至沙保氏葡萄糖琼脂凝胶培养基,放置于26℃培养箱内培养7d,无菌接种环刮取菌丝后放入15ml离心管,0.9%生理盐水冲洗菌落表面,收集真菌混悬液,利用血细胞计数板调整孢子数量为1×109CFU/mL。清洁级树鼩30只随机分为实验组(n=20)、空白对照组(n=10)。造模前3天,实验组及空白对照组树鼩右眼结膜下注射5mg/ml地塞米松注射液0.1ml。实验组用胰岛素针头(29G)行角膜上皮层划痕后将真菌孢子混悬液5uL滴注于角膜表面,空白对照组滴注生理盐水5uL;造模后第1d,第3d,第7d通过前段照相、共聚焦显微镜检查、病理组织学变化、感染角膜组织培养对模型进行评价。[结果]组织病理切片:炎性细胞浸润数量造模后第7天达到高峰,以中性粒细胞为主;共聚焦显微镜检查:真菌浸润范围、角膜上皮细胞和内皮细胞水肿程度、菌丝数量均与时间呈正相关,实验各时间点均可见菌丝平行于基质纤维生长;感染后角膜组织培养可见茄病镰刀菌生长;造模成功率为90%。[结论]采用角膜上皮层划痕滴注茄病镰刀菌孢子的方法首次成功建立树鼩茄病镰刀菌性角膜炎模型。第四部分NOD1及NF-kβP65在镰刀菌性角膜炎促炎反应中的作用[目的]研究在树鼩镰刀菌性角膜炎模型中,NOD1、NF-kβP65的表达是否与角膜中炎性细胞浸润数量及房水中促炎因子(IL-6、IL-8、TNF-α、)的释放有相关性。[方法]利用蛋白质免疫印迹检测NOD1、NF-kβP65的蛋白表达水平;免疫组织化学检测NOD1、NF-kβP65的表达变化;流式细胞仪检测房水中炎性细胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的变化。探索体内实验中,NOD1/NF-kβP65信号通路与促炎反应的相关性。[结果]实验组NOD1与NF-kβP65蛋白表达水平明显高于对照组;免疫组织化学染色:实验组NOD1染色强阳性,表达于角膜上皮细胞胞浆内;NF-kβP65染色强阳性,表达于角膜基质层中性粒细胞及角膜内皮细胞核内。与空白对照组相比,实验组房水中IL-6、IL-8、TNF-α浓度造模后第1天,第3天均明显升高(P<0.05)。[结论]树鼩镰刀菌性角膜炎角膜组织中NOD1与NF-kβP65蛋白高表达,NOD1蛋白表达于角膜上皮细胞。NF-kβP65蛋白主要表达于中性粒细胞及角膜内皮细胞,与中性粒细胞浸润数量及房水中促炎因子(IL-6、IL-8、TNF-α)浓度呈正相关。