基于新型纳米材料与核酸酶的传感器在生物分析中的应用

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背景蛋白质和核酸检测对于病原感染、遗传疾病、法医分析和现代生命科学的发展至关重要。但是,生物分析往往目标物含量少、杂质多,因而开发新型的高灵敏检测手段十分必要。纳米材料具有独特的光学性质和良好的生物相容性因而广泛应用于生物分析中。核酸酶是能够将核酸链的磷酸二酯键切断的酶,常作为一种重要的工具用于生物分析中。本研究通过新型的纳米材料核酸酶的DNA末端保护技术和信号放大技术构建了背景低、特异性好、灵敏度高的核酸与蛋白质检测的新方法。目的(1)构建基于阳离子共轭聚合物和外切酶Ⅰ的荧光检测方法用于蛋白质检测及细胞成像,实现链霉亲和素和叶酸受体的检测以及HeLa荧光成像;(2)构建基于核酸外切酶Ⅲ及MoS2纳米片荧光猝灭性能的DNA双重信号放大检测方法,实现人血色素沉着症基因的检测。方法(1)链霉亲和素(Strepavidin,SA)和生物素可以通过特异性结合,从而阻止探针核酸P1被核酸外切酶Ⅰ(Exonuclease Ⅰ,Exo Ⅰ)的消化,带正电荷的阳离子荧光共轭聚合物(Polymer poly(9,9-bis(6’-N,N,Ntrimethylammonium)hexyl)-fluorenylene phenylene dibromide,PFP)通过静电相互作用靠近P1,使得从PFP到荧光素(Fluorescein,FAM)发生荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET),从而实现对目标蛋白的检测;由于探针核酸P2的叶酸(Folate receptor,FR)和叶酸受体的高亲和力,PFP和P2可以连接到细胞表面,从PFP到P2发生FRET,从而成像HeLa细胞。(2)HP1与靶标的杂交引发核酸外切酶Ⅲ(Exonuclease Ⅲ,Exo Ⅲ)对其降解,释放出荧光基团、分子信标HP1、探针核酸T1和靶标DNA,释放的目标DNA可以与另一个HP1杂交并重新开始,T1可以与HP2杂交,Exo Ⅲ从杂化后H2的3’端逐步催化去除单核苷酸,释放荧光团,最终释放T1,少量的目标DNA在循环1和循环2中可以产生大量荧光片段从而达到信号放大的目的。结果(1)基于阳离子共轭聚合物和外切酶Ⅰ的荧光检测方法检测SA时,在浓度2-200 ng/mL范围内,FRET比值与SA浓度呈明显的线性关系,检测限低至1.3ng/mL,在1%血清中,FRET比值与SA浓度之间仍存在良好的线性关系;当HeLa细胞与P2、Exo I和PFP混合时出现蓝绿色荧光,从PFP到P2的FAM发生了FRET。(2)基于核酸外切酶III及MoS2纳米片荧光猝灭性能的DNA双重信号放大检测人血色素沉着症基因,线性范围为0.5-6.0 pM,检测限低至0.28 pM。结论(1)构建了基于阳离子共轭聚合物和Exo Ⅰ的蛋白检测方法被用于1%的血清检测、FR检测和细胞成像,其检测灵敏度更高,在生物医学领域具有应用潜力。(2)采用双重信号放大法和MoS2纳米片开发了一种高灵敏度和高选择性的DNA检测方法,方法简单、成本低经济,通过合理的设计相应的探针序列,可用于其他核酸检测。
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