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神经母细胞瘤断点家族(Neuroblastoma Breakpoint Family, NBPF)拥有24个成员，该家族成员与神经母细胞瘤及其他癌症的发生相关，这是一个在人类进化谱系上新出现的基因，由N端及不同数量的Olduvai结构域组成。Olduvai结构域在人类谱系上经历了快速且大量地增长，在人类中拥有最高数量的302个拷贝，在小鼠中只有1个拷贝，而在非哺乳动物中不存在。研究发现Olduvai的拷贝数异常与大脑脑尺寸有关，并与正常及病变的人脑灰质体积及神经元数目相关，Olduvai拷贝数的增加与人类头大综合征及自闭症相关，而拷贝数的减少与头小综合征及精神分类症有关。Olduvai结构域在人体各个组织中都表达，尤其在大脑认知相关的区域中高表达，且显示出神经元特异性表达。除了生物信息学和统计学手段证明Olduvai结构域在进化上和大脑认知型疾病相关以外，对Olduvai结构域及N端的生化性质一无所知。
NBPF15含有长度超过100个氨基酸的N端和6个不同亚型的Olduvai结构域。我们在体外合成了NBPF15核苷酸序列，通过酶切连接构建在不同的表达载体中，并进行了NBPF15全长及截短蛋白的表达。结果发现，全长NBPF15蛋白和只含有N端的蛋白都无法高效表达，而含有单个Olduvai结构域的截短蛋白表达效果较好。我们最终在大肠杆菌表达系统中成功得到了10个NBPF15截短蛋白，并对这些截短蛋白进行了多种生化分析，包括动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)，凝胶过滤层析(Superdex 200)，小角散射(Small angle X-ray scattering，SAXS)，远紫外圆二色谱(Far-UV circular dichroism，CD)，透射电子显微镜(Transmission electron microscope，TEM)和晶体学观察。
当蛋白同时含有N端和Olduvai结构域时会出现多种聚集状态，N端越长，蛋白的聚集状态越多，各聚集体之间的动态变化越强。逐步去掉N端时，蛋白的聚集状态逐渐从多种聚集体共存变成单一聚集体。拥有不同长度的N端NBPF15截短蛋白在透射电子显微镜下能观察到明显的形态差异，N端越长，蛋白的纤维状和聚集态越明显。SAXS实验证明只含有单个Olduvai结构域的截短蛋白在溶液中是均一稳定的非折叠单体，蛋白舒展的状态使得其在S200和DLS实验中表现出较大的表观分子量。含有N端和Olduvai结构域的蛋白在浓度为40mg/ml左右时，会自发地从溶液状态变成凝胶状，即相变。实验证明NBPF15N端引起蛋白出现多种聚集体是序列存在内在偏好的构象异质性。NBPF15含有多段本质无序区(lntrisincally disordered regions，IDRs)，NBPF15的N端属于IDRs中的两性电解质类，序列中均匀地分布着相似数量的酸、碱性氨基酸，而IDRs的存在会驱动蛋白发生相变，这可能是部分截短蛋白能发生相变的原因。CD结果证明NBPF15N端像是一段“镶嵌区”，由无序区-Cc．螺旋区一无序区组成，截短蛋白中α-螺旋的含量与蛋白发生相变的速度成正相关。通过对NBPF家族成员进行序列比对分析，发现NBPF家族的N端高度保守，因此NBPF15N端引起蛋白聚集和相变的性质有可能是NBPF家族成员的共性。鉴于Olduvai结构域也是高表达在与认知相关的脑区域中，我们合理地推测在体外发现的NBPF15N端引起蛋白出现多种聚集形式及相变的性质也可能与相关的大脑认知型疾病有关。
第二部分的研究是关于RNA解旋酶DDX43的酶学性质。DDX43是一种肿瘤特异性基因(Cancer/testis antigen，CTA)，是一种新型的癌症指示物。DDX43被认为能促进原癌基因的表达，在黑色素细胞瘤中，DDX43通过打开原癌基因NRAS的mRNA二级结构促进NRAS的表达和增殖，但是其具体作用方式和真正的功能也是未知范畴。DDX43是解旋酶超家族Ⅱ中DEAD-box的一员，除了拥有保守的解旋核心区(Helicase core)以外，在其N端还有一个负责结合ssDNA/RNA的KH结构域，在KH结构域和解旋核心区之间存在着一段长达100个氨基酸的Linker。
我们成功地在大肠杆菌表达系统中纯化得到了人的DDX43全长蛋白，发现DDX43在溶液中是均一的单体。由于解旋酶发挥功能时首先需要与底物结合，所以本实验系统地研究了DDX43的底物结合能力及序列偏好性。结果发现DDX43对于ssDNA/RNA拥有最强的底物亲和能力，Kd＜10nM，且单链底物长度需要大于等于12nt。对于碱基偏好性而言，DDX43更喜欢鸟嘌呤，偏好顺序为G＞T＞C＞A，对G的亲和力约为T的十倍。在DDX43的两个主要结构域中，KH结构域发挥主要的底物结合能力，其对底物的亲和力约为解旋核心区的两倍。Linker的作用方式是将KH结构域和解旋核心区物理地连接在一起，对Linker进行截短(去掉约30个氨基酸)或加长(引入3C酶切位点)都不会影响全长蛋白对底物的亲和力，而一旦将Linker截断，DDX43对底物亲和力会大幅下降。我们推测Linker区能维持解旋核心区和KH结构域之间的构象，而DDX43偏好单链底物是因为单链底物在结合过程中更容易被扭曲。此外，我们还使用了快速停留FRET技术(Stopped-flow)对DDX43的解旋活性进行测定，发现DDX43几乎没有体外解旋活力。
本实验系统定量地研究了DDX43与底物的亲和力，具体论证了DDX43各个结构域在底物亲和中的作用，证明Linker区的作用是物理地连接两个结构域从而维持蛋白对底物的高亲和力，为这个新的肿瘤标志物添上体外生化研究数据。
NBPF15含有长度超过100个氨基酸的N端和6个不同亚型的Olduvai结构域。我们在体外合成了NBPF15核苷酸序列，通过酶切连接构建在不同的表达载体中，并进行了NBPF15全长及截短蛋白的表达。结果发现，全长NBPF15蛋白和只含有N端的蛋白都无法高效表达，而含有单个Olduvai结构域的截短蛋白表达效果较好。我们最终在大肠杆菌表达系统中成功得到了10个NBPF15截短蛋白，并对这些截短蛋白进行了多种生化分析，包括动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)，凝胶过滤层析(Superdex 200)，小角散射(Small angle X-ray scattering，SAXS)，远紫外圆二色谱(Far-UV circular dichroism，CD)，透射电子显微镜(Transmission electron microscope，TEM)和晶体学观察。
当蛋白同时含有N端和Olduvai结构域时会出现多种聚集状态，N端越长，蛋白的聚集状态越多，各聚集体之间的动态变化越强。逐步去掉N端时，蛋白的聚集状态逐渐从多种聚集体共存变成单一聚集体。拥有不同长度的N端NBPF15截短蛋白在透射电子显微镜下能观察到明显的形态差异，N端越长，蛋白的纤维状和聚集态越明显。SAXS实验证明只含有单个Olduvai结构域的截短蛋白在溶液中是均一稳定的非折叠单体，蛋白舒展的状态使得其在S200和DLS实验中表现出较大的表观分子量。含有N端和Olduvai结构域的蛋白在浓度为40mg/ml左右时，会自发地从溶液状态变成凝胶状，即相变。实验证明NBPF15N端引起蛋白出现多种聚集体是序列存在内在偏好的构象异质性。NBPF15含有多段本质无序区(lntrisincally disordered regions，IDRs)，NBPF15的N端属于IDRs中的两性电解质类，序列中均匀地分布着相似数量的酸、碱性氨基酸，而IDRs的存在会驱动蛋白发生相变，这可能是部分截短蛋白能发生相变的原因。CD结果证明NBPF15N端像是一段“镶嵌区”，由无序区-Cc．螺旋区一无序区组成，截短蛋白中α-螺旋的含量与蛋白发生相变的速度成正相关。通过对NBPF家族成员进行序列比对分析，发现NBPF家族的N端高度保守，因此NBPF15N端引起蛋白聚集和相变的性质有可能是NBPF家族成员的共性。鉴于Olduvai结构域也是高表达在与认知相关的脑区域中，我们合理地推测在体外发现的NBPF15N端引起蛋白出现多种聚集形式及相变的性质也可能与相关的大脑认知型疾病有关。
第二部分的研究是关于RNA解旋酶DDX43的酶学性质。DDX43是一种肿瘤特异性基因(Cancer/testis antigen，CTA)，是一种新型的癌症指示物。DDX43被认为能促进原癌基因的表达，在黑色素细胞瘤中，DDX43通过打开原癌基因NRAS的mRNA二级结构促进NRAS的表达和增殖，但是其具体作用方式和真正的功能也是未知范畴。DDX43是解旋酶超家族Ⅱ中DEAD-box的一员，除了拥有保守的解旋核心区(Helicase core)以外，在其N端还有一个负责结合ssDNA/RNA的KH结构域，在KH结构域和解旋核心区之间存在着一段长达100个氨基酸的Linker。
我们成功地在大肠杆菌表达系统中纯化得到了人的DDX43全长蛋白，发现DDX43在溶液中是均一的单体。由于解旋酶发挥功能时首先需要与底物结合，所以本实验系统地研究了DDX43的底物结合能力及序列偏好性。结果发现DDX43对于ssDNA/RNA拥有最强的底物亲和能力，Kd＜10nM，且单链底物长度需要大于等于12nt。对于碱基偏好性而言，DDX43更喜欢鸟嘌呤，偏好顺序为G＞T＞C＞A，对G的亲和力约为T的十倍。在DDX43的两个主要结构域中，KH结构域发挥主要的底物结合能力，其对底物的亲和力约为解旋核心区的两倍。Linker的作用方式是将KH结构域和解旋核心区物理地连接在一起，对Linker进行截短(去掉约30个氨基酸)或加长(引入3C酶切位点)都不会影响全长蛋白对底物的亲和力，而一旦将Linker截断，DDX43对底物亲和力会大幅下降。我们推测Linker区能维持解旋核心区和KH结构域之间的构象，而DDX43偏好单链底物是因为单链底物在结合过程中更容易被扭曲。此外，我们还使用了快速停留FRET技术(Stopped-flow)对DDX43的解旋活性进行测定，发现DDX43几乎没有体外解旋活力。
本实验系统定量地研究了DDX43与底物的亲和力，具体论证了DDX43各个结构域在底物亲和中的作用，证明Linker区的作用是物理地连接两个结构域从而维持蛋白对底物的高亲和力，为这个新的肿瘤标志物添上体外生化研究数据。