研究背景和目的目前，在整个烧创伤领域，创面愈合是我们在烧创伤治疗中遇到的基本问题，而如何来促进皮肤烧创伤后创面的修复是烧创伤治疗的主要任务。烧创伤后的创面愈合是个非常复杂的过程[1]，它包含了各种细胞、各种因子以及在这些细胞和因子之间的错综复杂的关系[2]，涉及到了细胞运动、细胞黏附、细胞增殖和细胞分化等细胞生物学的多个方面，但在这些过程中主要包括两个方面的内容：肉芽组织的形成以及创面再上皮化，在创面再上皮化这个过程中，表皮细胞的迁移又被认为是决定创面愈合的一个关键步骤，这也是目前国内以及世界上创面愈合研究的焦点。目前的研究认为，人皮肤在急性损伤后，如各种烧创伤会使创面处于一个暂时的缺氧状态，这个缺氧微环境可以促进人表皮细胞的迁移，来完成我们皮肤的创面愈合，在体外实验中也证实了缺氧微环境下表皮细胞的迁移能力会增强[3]，但其具体机制目前尚不明确。表皮细胞的迁移过程是一个复杂的细胞学行为，涉及表皮细胞与细胞外各种基质的相互作用，包括细胞骨架的重组以及细胞的非对称性分裂增殖（asymmetric divisions）等等[4]，在细胞迁移的每一个步骤当中，都包含着细胞骨架特别是微管蛋白动力学的变化[5]，需要进行一系列的生化级联反应对微管蛋白动力学来进行调控，以便确保细胞在迁移速度和方向上的有效性及可控性。目前有研究已经证实缺氧条件下可以调控微管动力学[6]。所以，本研究就模拟人皮肤烧创伤后的局部缺氧微环境下，来观察微管相关蛋白4(microtuble-associate protein4，MAP4)在人永生化表皮细胞（HaCaT细胞）中的表达变化和对细胞迁移能力的影响，并试图研究其机制。我们在前期研究基础上，建立起了HaCaT细胞的缺氧模型，并采用体外细胞划痕实验、Tanswell细胞迁移实验、免疫共沉淀(immunoprecipitation，IP)、免疫荧光染色（immumofluorescence，IF）以及蛋白免疫印迹（western blot，WB）技术等实验方法来观察HaCaT细胞在缺氧处理后细胞骨架蛋白的变化情况，MAP4在HaCaT细胞中的表达变化及其对细胞迁移能力的影响，并研究MAP4与细胞动力蛋白轻链1（Tctex-1）的关系及它们对HaCaT细胞迁移能力的影响。研究方法本研究共分为三部分：第一部分：系统观察缺氧微环境下HaCaT细胞迁移能力的变化及细胞微管动力学的动态变化1.建立HaCaT细胞缺氧模型和培养方法：采用混合缺氧气体预充方式（1%O2，94%N2，5%CO2），利用简易输液袋密封后用真空泵抽气后灌注混合气体来进行细胞缺氧处理及细胞培养，方法简便可行，细胞培养良好，无明显不适现象。2.设置细胞缺氧处理时间：24h，采用两种体外细胞迁移模型（细胞体外划痕实验和Tanswell细胞迁移实验）来观察缺氧微环境下HaCaT细胞迁移能力的变化。所有实验数据都用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS20.0软件进行统计，采用单因素方差分析,两两比较行t检验，以P＜0.05为统计学上有差异，P＞0.05为差异在统计学上无意义。3.设置3个不同的细胞缺氧时间点：0.5h、1h及3h，采用IF实验通过观察HaCaT细胞骨架蛋白的主要成分α-微管蛋白（α-tubulin）的变化来观察细胞微管动力学的动态变化。第二部分：缺氧微环境下MAP4对微管动力学的调控及HaCaT细胞迁移能力的影响1.设置4个不同的细胞缺氧时间点：0.5h、1h、3h及24h，采用WB实验观察缺氧微环境下MAP4及磷酸化MAP4（p-MAP4）在HaCaT细胞中的表达变化。2.构建MAP4的高、低表达载体，转染HaCaT细胞，通过筛选建立稳定的MAP4高、低表达的HaCaT细胞模型，采用细胞体外划痕实验、Tanswell细胞迁移实验及IF实验来观察缺氧微环境下该细胞模型迁移能力的变化以及细胞微管动力学的动态变化。细胞缺氧处理时间同上，实验分组为：正常HaCaT组、高表达MAP4组、低表达MAP4组。第三部分：缺氧微环境下Tctex-1与MAP4的作用关系及对HaCaT细胞微管动力学的调控和细胞迁移能力的影响1.设置4个不同的细胞缺氧时间点：0.5h、1h、3h及24h，采用WB实验观察缺氧微环境下正常HaCaT组和高、低表达MAP4组中MAP4、p-MAP4及Tctex-1的表达变化。2.构建Tctex-1的高、低表达载体，转染HaCaT细胞，通过筛选建立稳定Tctex-1高、低表达的HaCaT细胞模型，采用WB实验观察缺氧微环境下Tctex-1高、低表达细胞模型中MAP4、p-MAP4及Tctex-1的表达变化，细胞缺氧时间点同上。3.采用细胞体外划痕实验、Tanswell细胞迁移实验及IF实验来观察缺氧微环境下Tctex-1的高、低表达细胞迁移能力的变化以及细胞微管动力学的动态变化。细胞缺氧处理时间同上，实验分组为：正常HaCaT组、高表达Tctex-1组、低表达Tctex-1组。研究结果1.成功建立了HaCaT细胞缺氧模型和培养方法。2.细胞体外划痕实验和Tanswell细胞迁移实验结果显示：缺氧处理后，增强了HaCaT细胞的迁移能力（P＜0.05）。3. IF实验结果显示：早期缺氧处理后，HaCaT细胞的骨架蛋白α-tubulin开始解聚向胞体周缘聚集，细胞骨架变得疏松，细胞形态开始呈现多形性，细胞变得不稳定。4.缺氧处理后，WB实验结果显示：早期缺氧后（0.5h-1h），HaCaT细胞中MAP4和p-MAP4的表达会有短暂性的提高，随着缺氧时间的延长（3h-24h），MAP4和p-MAP4的表达会迅速降低（P＜0.05）。5.成功建立了MAP4高、低表达的HaCaT细胞模型，细胞体外划痕实验和Tanswell细胞迁移实验结果表明：与正常HaCaT组相比，低表达MAP4组细胞迁移能力明显受到抑制，缺氧处理后（24h）亦无明显提高。而高表达MAP4组细胞迁移能力在缺氧后增加明显（P＜0.05），高、低表达对照组无明显变化。IF实验结果显示：与正常HaCaT组相比，缺氧后低表达MAP4组细胞形态皱缩，骨架蛋白α-tubulin解聚不明显，无边集化现象，细胞迁移倾向不明显。高表达MAP4组细胞在缺氧时间延长后细胞骨架蛋白α-tubulin变化趋势与正常HaCaT组相似。6.缺氧处理后，与正常HaCaT组相比，高表达MAP4组细胞中MAP4和p-MAP4的表达明显增加，变化趋势相同，低表达MAP4组中MAP4和p-MAP4的表达明显降低。Tctex-1的表达在早期缺氧后会短暂降低（0.5h），随着缺氧时间延长表达增加（P＜0.05），呈现递增趋势，且高表达MAP4组会增加Tctex-1的表达，相应的低表达MAP4组会降低Tctex-1的表达的表达。7.成功建立了Tctex-1高、低表达的HaCaT细胞模型。两种细胞迁移实验结果表明：与正常HaCaT组相比，低表达Tctex-1组细胞迁移能力明显受到抑制，而高表达Tctex-1组细胞迁移能力增加明显（P＜0.05），高、低表达对照组无明显变化。IF实验结果与高、低表达MAP4组细胞相似，高表达Tctex-1组细胞在缺氧后（24h）细胞骨架蛋白α-tubulin解聚明显，出现边集化现象，细胞骨架疏松，细胞呈现多形性，变得不稳定而易于迁移。低表达Tctex-1组细胞皱缩，骨架蛋白解聚不明显，无边集化现象，缺氧后亦无明显改变。8. WB实验检测到：缺氧处理后（时间点同上），高、低表达Tctex-1组中MAP4、p-MAP4和Tctex-1的表达变化趋势同高、低表达MAP4组，且高表达Tctex-1组可以提高MAP4的表达，相应的低表达Tctex-1组亦可以降低MAP4的表达（P＜0.05），现象同上。结论：缺氧微环境下可以调控HaCaT细胞中MAP4和Tctex-1的表达及细胞微管动力学的变化，使细胞的迁移能力得到增强，其作用机制可能是缺氧微环境调控了MAP4的表达或者活性，进而影响Tctex-1在HaCaT细胞的表达发生变化，共同来调控细胞微管动力学影响表皮细胞的迁移。