双生病毒是一类世界范围内广泛发生的单链环状DNA病毒,主要以滚环复制的方式进行病毒基因组的复制。与此类病毒致病性紧密相关的新型卫星分子DNAβ依赖病毒DNA-A进行复制。为了进一步了解DNAβ复制的机制,本论文对烟草曲茎病毒(Tobacoo curly shoot virus, TbCSV)的复制相关蛋白基因(replication-associated protein,Rep)进行了原核表达,并对Rep的核酸结合特性进行了初步研究。 为了提高TbCSV Rep在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达量,我们研究了大肠杆菌菌株、温度、诱导时间以及诱导剂IPTG终浓度等不同条件对GST-Rep融合蛋白表达量的影响。结果表明,大肠杆菌菌株Rosetta在37℃培养3hr后,使用终浓度为0.5mmol/L的IPTG在28°C诱导培养4hr时,GST-Rep融合蛋白表达量最高,表达的GST-Rep融合蛋白可占细菌总蛋白的42%。用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST-Rep融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE表明GST-Rep融合蛋白大小约为66 kDa,与预计的分子量大小一致,Western blot分析表明其能与GST多克隆抗体起特异性反应。Rep基因的优化表达为研究该基因的作用机理打下基础。 双生病毒编码的Rep具有结合核酸的能力。为了验证Rep能否结合DNAβ,我们利用TbCSV-Y35 Rep蛋白进行了核酸结合试验。以全长TbCSV-Y35 DNAβ分子作为探针,结果表明TbCSV-Y35 Rep蛋白能结合单、双链DNAβ。