【摘 要】
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研究背景:结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,Mtb）感染引起的人畜共患传染病。巨噬细胞作为Mtb的主要靶细胞可通过自噬清除病原菌,有效抑制Mtb在宿主细胞内的增殖。机体一旦被感染,巨噬细胞会重新调整细胞代谢以适应感染并产生足够的能量来执行宿主防御功能。研究表明,谷氨酰胺作为巨噬细胞的主要代谢底物,通过谷氨酰胺酵解途径,为巨
【基金项目】
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宁夏科技创新领军人才培养项目（No.KJT2017002）；
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研究背景:结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,Mtb）感染引起的人畜共患传染病。巨噬细胞作为Mtb的主要靶细胞可通过自噬清除病原菌,有效抑制Mtb在宿主细胞内的增殖。机体一旦被感染,巨噬细胞会重新调整细胞代谢以适应感染并产生足够的能量来执行宿主防御功能。研究表明,谷氨酰胺作为巨噬细胞的主要代谢底物,通过谷氨酰胺酵解途径,为巨噬细胞的免疫应答提供能量支持,在宿主防御结核分枝杆菌感染中发挥重要作用。此外,谷氨胺代谢还可以参与细胞自噬的调节。其中,谷氨酰胺酶1（Glutaminasel,GLS1）作为谷氨酰胺代谢中的关键酶,是目前谷氨酰胺分解途径研究较广泛的药物靶点。近来研究发现,GLS1酶活性减弱能够降低多种病毒的复制。但关于Mtb感染巨噬细胞过程中GLS1的作用尚有待阐明。目的与方法:本试验以小鼠单核巨噬细胞RAW264.7为研究对象,利用卡介苗（Bacille Calmette-Guerin vaccine,BCG）感染并通过小干扰RNA敲减巨噬细胞内GLS1的表达。采用透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜、ELISA、q-PCR和Western blot等技术,从形态学和分子水平检测自噬相关指标,阐明GLS1对BCG诱导的巨噬细胞自噬的调控作用,并初步探讨其机制。结果:（1）BCG 感染显著增加 LC3B（p＜0.01）、Beclinl（p＜0.01）和 GLS1（p＜0.01）的表达;显著降低巨噬细胞内谷氨酰胺含量（p＜0.01）。最佳感染条件为:感染复数为10 MOI,感染时间为12 h。敲减GLS1显著下调BCG感染后巨噬细胞内GLS1（p＜0.01）的表达。（2）在BCG感染巨噬细胞的过程中,敲减GLS1显著降低了细胞的自噬率（p＜0.05）,抑制了自噬体和自噬溶酶体的形成以及自噬流的发生,显著下调了自噬相关蛋白LC3B（p＜0.05）、ULK1（p＜0.001）、Beclinl（p＜0.01）、ATG5（p＜0.01）、ATG7（p＜0.001）和 ATG12（p＜0.01）的表达,促进P62（p＜0.01）的积累。同时,敲减GLS1显著增加了 BCG感染后巨噬细胞内谷氨酰胺的含量（p＜0.05）。（3）敲减GLS1显著促进了 BCG感染巨噬细胞后mTOR通路相关因子p-PI3K（p＜0.001）、p-AKT（p＜0.001）和p-mTOR（p＜0.001）的表达;同时,在BCG感染过程中,用雷帕霉素抑制mTOR诱导细胞发生自噬时,敲减GLS1对自噬相关因子LC3B、ATG5、ATG12和ATG7的表达没有影响。以上结果表明,敲减GLS1是通过mTOR依赖途径调控BCG诱导的巨噬细胞自噬。（4）敲减GLS1显著增加巨噬细胞内谷氨酰胺含量（p＜0.05）,并能够激活mTOR信号通路。提示GLS1可能是通过改变细胞内谷氨酰胺的含量激活mTOR信号通路抑制自噬的发生。进一步验证表明,剥夺培养液中的谷氨酰胺处理细胞后,敲减GLS1对mTOR、LC3B、Beclin1、ATG7、ATG5和ATG12蛋白的表达量以及自噬流的发生无显著影响。以上结果表明,敲减GLS1通过增加巨噬细胞内谷氨酰胺含量激活mTOR抑制自噬。结论:敲减GLS1后可通过增加巨噬细胞内谷氨酰胺的含量激活mTOR依赖途径调控细胞自噬。
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