第一部分两步法构建单通道海藻酸盐组织工程支架研究背景:由于目前体外药物筛选常常采用二维（2D）研究平台,2D和3D在细胞-细胞以及细胞-基质等空间结构的差异,常引起细胞内信号分子表达、分布差异,最终导致细胞形态和功能明显差异,因此,采用组织工程技术构建3D组织工程产品,除用于再生医学以外,作为高仿生性药物筛选平台应用于新药筛选也是其重要应用领域。生物打印是一种生物增材技术,可通过计算机辅助设计将不同细胞、生物材料等打印至精确的空间位置,通过层层打印,最终实现自动化构建高仿生的活性3D组织。通过生物打印方法构建组织工程产品在近十年来获得了迅猛发展。同轴打印技术作为一种特殊的生物打印方法,由于可便捷打印多样的鞘/核结构组织工程支架,在再生医学和新药研发领域具有重要的应用前景。本研究拟优化同轴打印组织工程支架技术,为进一步构建新药筛选平台奠定基础。目的:目前同轴打印研究报道都是通过“一步法”构建组织工程支架,即同轴打印支架与三维组织构建同步完成。本研究提出“两步法”构建海藻酸盐组织工程支架,即第一步使用同轴打印技术构建三维海藻酸盐微通道支架,第二步灌注细胞和水凝胶基质,从而可以构建出各种基质材料的组织工程支架。本研究拟验证通过“两步法”构建的支架灌注不同种类水凝胶基质的可行性,通过检测交联剂浓度、水凝胶种类、细胞密度、混合比例及支架层数对细胞活性及功能的影响,进一步确定“两步法”构建方法的稳定性和广泛适用性。方法:（1）借助同轴喷头和3D生物打印系统,打印具有微通道结构的多层海藻酸盐支架,验证材料浓度对支架可打印性的影响。（2）在最佳的打印浓度下打印具有4层结构的海藻酸盐支架,测定支架的机械性能。（3）在不同层数的海藻酸盐微通道支架中灌注浓度为30%的GelMA溶液,分别在有无培养基存在的条件下于312 nm的紫外光下进行光交联,观察培养基的存在和支架层数对GelMA光交联的影响。（4）通过死活染色法检测交联剂浓度、水凝胶种类、细胞密度、细胞与水凝胶混合比例对海藻酸盐支架中HUVECs细胞活性的影响。（5）将密度为2×10⁶ cells/mL的HepG2细胞与Fibrin水凝胶按1:1比例混合后灌注于不同层数支架内进行长期培养:分别于第1,3,6,9天通过死活染色法检测支架内的细胞活性,Alarma Blue试剂盒检测细胞的增殖能力,ELISA试剂盒测定白蛋白的分泌量,改良Jung法检测尿素的合成量。结果:（1）当海藻酸钠浓度为3%⁴%,CaCl₂浓度为2%⁴%时,具有较好的打印性,所打印出的海藻酸盐多层支架结构均匀,内部通道完整且连续,可支持气体及液体的灌注。（2）机械性能测试结果显示,以浓度为3%的海藻酸钠溶液打印的4层海藻酸钠支架具有较高的压缩模量。（3）在有无培养基存在下,支架内GelMA水凝胶均可发生光交联反应,交联时间受支架层数影响,第一层交联时间约为1.5 min,第二层和第四层交联时间分别约为2.5 min和6.5 min,8层和10层的交联时间约为17 min和20 min,11层以上在30 min内不能发生交联反应。（4）死活染色结果显示,未交联组中的细胞存活率为95.73%±2.78%,浓度为1%、2%和3%的交联剂组中的细胞活性分别为95.67%±1.17%、95.07%±2.38%和89.4%±0.67%,结果无显著性差异（P>0.05）。（5）死活染色结果表明支架内的细胞密度、水凝胶种类及细胞与水凝胶的混合比例对细胞活性无影响,且各组中的细胞活性均>90%,结果无显著性差异（P>0.05）。（6）死活染色结果表明,4层和8层支架在第1,3,6,9天的细胞活性均>90%,结果无显著性差异（P>0.05）,Alarma Blue检测结果显示,8层支架中细胞在第1,3,6,9天的增殖率约为4层支架的两倍,ELISA与QuantiChromTM Urea检测结果显示8层支架在第1,3,6,9天所分泌的白蛋白和尿素总量约为4层支架的两倍,证明支架层数对细胞活性和分泌功能没有影响。结论:基于“两步法”同轴生物打印技术构建了三维海藻酸钠多层组织工程支架,该方法可支持不同种类水凝胶和细胞的灌注,细胞在支架中的生长增殖稳定,且能维持细胞的分泌功能,说明该构建方法具有良好的可行性、稳定性和适用性。第二部分同轴打印可灌流双通道海藻酸盐组织工程支架目的:使用同轴生物打印技术构建具有内置双通道的海藻酸盐组织工程支架,建立灌流培养方法,验证灌流培养对支架内细胞的活性及功能的影响。方法:（1）借助特殊同轴喷头打印可灌流的双通道海藻酸盐支架,验证打印参数对双通道支架管径及两通道间管壁厚度的影响。（2）将密度为2×10⁶cells/mL的HepG2细胞与浓度为1%的海藻酸钠溶液按照1:1混合后灌注于双通道支架的一侧通道中,放于1%的CaCl₂溶液中待其交联,将双通道管的另一侧通道接入灌流装置,进行灌流培养,分别在第1,3,5,7天使用死活染色试剂盒测定灌流培养与常规培养下的细胞活性;CCK-8试剂盒检测灌流培养下细胞的增殖能力;灌流培养下,收集1,3,5,7天的细胞培养基,通过改良Jung法检测尿素的合成量,ELISA测定白蛋白的分泌量。结果:（1）光学显微镜检测显示,双通道海藻酸盐支架的内外径随着CaCl₂溶液的流出速度和海藻酸钠溶液的挤出速度的增大而增加,差异具有统计学意义（P<0.05）;CaCl₂溶液和海藻酸钠溶液的浓度对管径没有规律性影响;两空心管间管壁厚度与CaCl₂和海藻酸钠溶液流速有关,海藻酸钠溶液的挤出速度越大,两空心管间管壁越厚,CaCl₂溶液的流出越大,两空心管间管壁越薄,差异具有统计学意义（P<0.05）;（2）死活染色结果显示,与常规培养相比,灌流培养下的细胞活性在第1天与常规培养下细胞活性相当,第3、5、7细胞活性均高于常规培养,差异具有统计学意义（P<0.05）;CCK-8检测结果显示,灌流培养条件下,细胞在1,3,5天增殖呈上升趋势,第7天增殖能力降低;ELISA检测结果显示,灌流培养条件下白蛋白的分泌量在1,3,5天呈上升趋势,第5天白蛋白分泌量最高,第7天分泌量有所下降;QuantiChromTM Urea检测结果显示,灌流培养条件下尿素的分泌趋势与白蛋白相同。结论:通过同轴生物打印技术构建了可灌流的双通道海藻酸盐支架,建立了灌流培养方法,显著提高了细胞活性并维持了细胞的分泌功能,说明灌流培养方法在提高细胞活性及功能方面具有良好的可行性。