固氮作用（nitrogen fixation）是分子态氮被还原成氨和其他含氮化合物的过程。自然界氮（N2）的固定主要有两种方式:一种是化学固氮,另一种是生物固氮。其中,共生固氮是生物固氮的主要来源,是土壤肥力的主要贡献者。在豆科植物中,根瘤菌与豆科植物通过精密的分子对话相互识别,并形成侵染线,待侵染线到达内皮层细胞诱导根瘤原基的形成,根瘤原基进一步发育成根瘤。在此过程中,许多共生基因及信号途径在共生固氮过程中发挥着重要作用。另一方面,由于根瘤菌与豆科植物能够形成根瘤根瘤菌的侵染植物的过程与病原体感染植物模型类似,所以难免会引起植物的防御反应。但根瘤菌与豆科植物共生过程中,可以分泌共生信号,如结瘤因子和效应蛋白来抑制植物免疫反应,为其入侵和定殖于根瘤中提供条件。这种共生和免疫机制的研究对高效利用生物的共生固氮体系,发挥农业的可持续发展具有非常重要的作用。目前,根瘤菌通过三型分泌系统分泌的效应蛋白是如何调控植物免疫和共生固氮的,这其中的分子机制还不太清楚,为了进一步研究其分子机制,我们选用豆科植物大豆（williams82）作为实验材料,并使用野生型根瘤菌菌株Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110和三型分泌系统缺失的根瘤菌B.diazoefficiens USDA110（△T3SS）接种大豆（同时设立对照组未接种根瘤菌的大豆）,统计25dpi的表型,与野生型USDA110根瘤菌菌株侵染的大豆相比,用△T3SS型根瘤菌侵染大豆,结瘤数目明显减少,鲜重明显减少,结瘤密度减小,根瘤的固氮酶活力也明显升高,根瘤颜色变浅（正常野生型接种根瘤颜色为粉红色）,为了揭示根瘤内部结构是否变化,我们发现△T3SS接种的大豆根瘤内部的颜色也同样变浅,之后又对其进行了甲苯胺蓝染色,发现两者的类菌体结构并没有被破坏,但是在△T3SS型根瘤菌接种的大豆根瘤中,侵染细胞所占比例明显减小。与此同时,我们选择了20颗大豆,分成两组,观察了接种两种不同根瘤菌的两组大豆结瘤起始时间,统计观察结果显示接种野生型根瘤菌USDA110的大豆一般在接种根瘤菌7d左右时开始结瘤,然而,接种了△T3SS型根瘤菌的大豆一般在接种根瘤菌后9d左右开始结瘤,从而证实了用△T3SS接种的大豆具有结瘤起始延迟的现象。为了探究出现上述表型变化的原因,我们采用荧光定量PCR的方法,分别对接种了USDA110以及接种了△T3SS后14d时的大豆根瘤中的一些基因进行了荧光定量分析,这些基因包括:共生基因NIN,ENOD11,ENOD40和免疫基因PR-like C,PR-like D,Rboh F,结果表明:用△T3SS型根瘤菌接种大豆形成的根瘤在14 dpi时免疫基因的表达量普遍偏高,这表明了T3SS对共生固氮和免疫过程具有一定的影响,并暗示着T3SS在共生固氮与免疫过程发挥着重要作用。为了进一步研究T3SS的缺失对大豆共生免疫的分子机制的影响,我们分别收取未接种根瘤菌的大豆根部材料（作为对照组）,以及接种了USDA110和△T3SS后7d和14d的大豆根部材料进转录组测序,经过生物信息学手段分析发现,用根瘤菌处理了7d的大豆样品共有40个上调表达的差异表达基因和96个下调差异表达基因。用根瘤菌处理了14d的大豆样品中有1882个基因上调和1703个下调差异表达基因,我们从这些差异表达基因中选择了一些感兴趣的基因,用q RT-PCR验证RNAseq结果,最终选择USDA110 VS△T3SS组中的上调差异表达基因:GmSAM,GmNB-NRCT,下调差异表达基因GmNodulin-C,GmFBM,GmGST,GmRING2,GmLYM,GmHLH,GmGluc6,Gmppyru,GmLYK13a和GmLYK13b来进行深入的研究。首先将这些基因的启动子克隆到p Dx2181-mcherry载体上,以便对这些基因进行组织特异表达分析。其次,对GmLYK13a,GmLYK13b和GmPR-like进行RNAi敲除和过表达实验,探究他们在共生固氮中的作用。我们最终期望利用三亲本杂交技术找到能够对大豆共生固氮产生抑制效应的效应因子。从而进一步探究T3SS对共生固氮过程的分子机制的影响,以全面了解大豆共生固氮的机制,这为应用至生产实践等领域打下了基础。