研究背景及目的:结外NK/T细胞淋巴瘤（extranodal Natural Killer/T cell lymphoma,ENKTL）是一类来源于成熟的T细胞和NK细胞的非霍奇金淋巴瘤亚型。ENKTL具有高度侵袭性,病程进展较快,易复发,生存期短,预后差等特点。传统淋巴瘤化疗方案（如CHOP方案）对ENKTL疗效较差,完全缓解（complete response,CR）率不足40%,这可能与多药耐药基因的高表达有关。近年来,ENKTL在治疗上所取得的进展主要是由于天冬酰胺酶和吉西他滨的应用,研究证实,使用以天冬酰胺酶/吉西他滨为基础化疗方案的患者其预后比传统以蒽环类为基础的化疗方案明显改善。但是仍有20%-40%的患者难以达到CR或CR后复发,对化疗药物耐药是导致治疗失败的主要原因。因此探讨ENKTL的耐药机制以及寻找逆转耐药的可行途径对提高ENKTL疗效及预后至关重要。ENKTL的耐药机制极其复杂,肿瘤微环境的改变便是其中之一。肿瘤微环境的功能异常会通过多种作用促进淋巴瘤细胞的增殖及耐药性,并且淋巴瘤细胞的增殖依赖于肿瘤微环境中某种信号（抗原、细胞因子等）的刺激。镜下观察ENKTL组织可发现大量的急性及慢性炎症细胞的浸润,同时这些炎症细胞可分泌大量的细胞因子,如TNF-α、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ以及IL-10等。IL-10是一种双向免疫调节因子,对肿瘤同样具有双重作用。一些研究认为IL-10作为一种免疫抑制因子,可以促进肿瘤细胞免疫逃逸的发生,对肿瘤的生长有促进作用,同时也有研究认为IL-10可以抑制肿瘤的血管生成与肿瘤细胞转移,从而起到抗肿瘤的作用。总的来说,IL-10在肿瘤发生发展过程中发挥双重作用。当肿瘤开始形成时,IL-10可能主要起刺激NK和CTL介导的肿瘤细胞杀伤作用。然而,当肿瘤细胞自身开始表达IL-10R,则肿瘤微环境中产生的IL-10可能主要发挥一种促癌作用。IL-10作为一种重要的炎性因子与ENKTL的发生和预后关系密切,而与ENKTL耐药的相关性目前尚无研究报道。ATP 结合盒（ATP-binding cassette transporter,ABC）膜转运蛋白家族是一类重要的细胞内转运蛋白。ABC膜转运蛋白是一类ATP驱动泵,通过ATP水解供能将细胞内化疗药物泵出,降低细胞内药物浓度,进而影响药物的敏感性。目前发现的ABC膜转运蛋白家族至少包括46个成员,分为7个亚家族,其中ABCB、ABCC、ABCG与多药耐药的发生密切相关。在ENKTL的耐药机制中,ABC膜转运蛋白家族同样扮演了重要的角色。如P-gp由ABCB1/MDR1编码,在ENKTL中异常表达,并与阿霉素等药物耐药性相关。基因测序发现,与正常NK细胞相比,淋巴瘤细胞系YTS和SNK-6中ABCC4、ABCC5、ABCG2等耐药基因高表达。目前,ABC膜转运蛋白在ENKTL中发挥耐药作用的上游刺激因子尚不清楚。基于上述基础,本课题拟研究IL-10参与ENKTL多药耐药的分子机制,从而寻找逆转ENKTL多药耐药的可行方案,为ENKTL的临床治疗提供新的思路以改善ENKTL患者预后。本研究中首先检测ENKTL患者治疗前外周血中IL-10水平,结合临床资料分析IL-10与ENKTL多药耐药的关系,以及与患者临床特征之间的关系。为进一步研究IL-10在ENKTL中的作用,我们分别在体外及体内用IL-10刺激YT及NK-92细胞或荷瘤小鼠,检测细胞的增殖、凋亡、周期分布及小鼠肿瘤的生长,探讨IL-10与YT及NK-92细胞耐药之间的关系,并进一步寻找IL-10在刺激YT及NK-92耐药中可能作用的耐药相关蛋白及信号传导通路。第一章IL-10在结外NK/T淋巴瘤中的表达及临床意义目的:通过酶联免疫吸附试验测定患者血清中IL-10的浓度,并进一步分析与临床特征及疗效的关系。通过免疫组化测定ENKTL耐药患者组织标本中ABC膜转运蛋白家族中P-gp、ABCG2、ABCC4、ABCC5、MRP1的表达情况,以寻找与IL-10相关的耐药蛋白。材料与方法:1.收集50例结外NK/T细胞淋巴瘤初治患者血清,根据治疗效果分为治疗有效组和治疗无效组,各25例,以50例健康志愿者血清为对照,应用酶联免疫吸附试验检测患者血清中IL-10的浓度,并分析三组之间的差异。另外收集8例耐药NK/T细胞淋巴瘤患者肿瘤组织标本。本研究所有实验方案均经郑州大学第一附属医院伦理委员会审批同意。2.分析血清IL-10浓度与患者临床特征之间的关系。3.免疫组织化学染色检测对吉西他滨耐药的结外NK/T细胞淋巴瘤患者肿瘤组织中ABC超家族耐药相关蛋白（P-gp、ABCG2、ABCC4、ABCC5、MRP1）的表达。结果:1.在结外NK/T细胞淋巴瘤患者外周血清中IL-10浓度为33.31±12.68pg/ml,而在健康志愿者外周血清中IL-10的浓度为14.21±6.46 pg/ml。结外NK/T淋巴瘤患者外周血清中IL-10浓度显著高于健康志愿者,差异具有统计学意义,P＜0.01。治疗有效组患者血清IL-10浓度为25.22±5.24pg/ml,治疗有效组患者血清IL-10浓度为24.01±4.22pg/ml,治疗无效组患者血清IL-10浓度为43.28±10.98 pg/ml,治疗无效组患者外周血清IL-10浓度显著高于治疗有效组,差异具有统计学意义,P＜0.01。2.血清IL-10浓度和患者的年龄、性别、Ann Arbor分期及IPI评分没有相关性,而与PINK评分、血清LDH是否升高、是否有B症状、EBV拷贝数是否大于5000有显著相关性,差异具有统计学意义,P＜0.01。3.在8例结外NK/T细胞淋巴瘤组织标本中,ABCG2、ABCC4、ABCC5、P-gp均为阳性表达,MRP1表达为阴性。其中,ABCC5呈现高表达状态,ABCG2、ABCC4和P-gp则呈现中度表达状态。结论:1.ENKTL患者血清IL-10浓度较健康志愿者升高。治疗无效组ENKTL患者血清IL-10浓度高于治疗有效组。2.ENKTL患者血清IL-10浓度与患者PINK评分、LDH水平、是否伴随B症状和EBV拷贝数相关。3.耐药相关蛋白ABCG2、ABCC4、ABCC5、P-gp在对吉西他滨耐药ENKTL患者组织标本中表达阳性。第二章 IL-10对结外NK/T淋巴瘤细胞株YT及NK-92的耐药性及机制研究目的:IL-10在体外刺激ENKTL细胞株YT及NK-92,研究IL-10对YT及NK-92细胞的生物学作用及IL-10与YT及NK-92细胞耐药之间的关系,并进一步验证IL-10与ABC膜转运蛋白的相关性并研究二者之间作用的分子机制。材料与方法:1.不同浓度的IL-10（0、1、5、10、20、50ng/ml）和不同浓度的吉西他滨（1、5、7.5μg/ml）分别作用于YT及NK-92细胞,24h后,CCK-8法检测各组细胞活性,Graphpadprism软件分析各IL-10作用浓度下,吉西他滨的IC50值。2.使用不同浓度的IL-10（0、1、5、10、20、50ng/ml）和终浓度为5μg/ml的吉西他滨作用于YT及NK-92细胞,24、48、72小时后,CCK-8法各组细胞活性。3.我们将YT及NK-92细胞分为4组,分别为空白对照组、IL-10组、IL-10+GEM组、GEM组,IL-10组给予IL-10 1ng/ml的刺激,GEM组给予吉西他滨5ng/ml的刺激,IL-10+GEM组同时给予IL-10和吉西他滨刺激,24、48、72小时后CCK8法测定细胞活性。4.流式细胞仪检测IL-10和吉西他滨作用后细胞周期分布。5.流式细胞仪检测IL-10和吉西他滨作用后细胞凋亡率。6.Western Blot检测IL-10和吉西他滨作用后细胞内ABCG2、ABCC4、ABCC5、P-gp 的表达。7.Western Blot检测各组细胞内信号通路蛋白STAT1、STAT3、JAK1、Tyk2及其磷酸化蛋白的表达。结果:1.IL-10浓度为0、1、5、10、20、50ng/ml时,吉西他滨对YT细胞的IC50值分别为:5.36μg/ml、6.86μg/ml、7.03μg/ml、6.42μg/ml、5.64μg/ml。5.77μg/ml（P＜0.05）;吉西他滨对 NK-92 细胞的 IC50 值分别为:7.94μg/ml、10.89μg/ml、10.26μg/ml、9.54μg/ml、8.26μg/ml、7.85μg/ml（P＜0.05）。2.当IL-10浓度为1 ng/ml或5 ng/ml时,YT和NK-92细胞活性显著增加。当IL-10浓度为10 ng/ml时,NK-92细胞活性也增加。然而,随着IL-10浓度的升高（20和50 ng/ml）,细胞存活率没有显著变化。3.与空白对照组相比,IL-10组细胞有轻度的增殖,GEM组细胞明显受到抑制,而IL-10和吉西他滨联合作用后,吉西他滨对YT及NK-92细胞的抑制作用明显减弱,各组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。4.与对照组相比,IL-10对细胞周期影响不大。吉西他滨作用后,G0/G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显降低（P＜0.05）。而IL-10与吉西他滨共同作用后,与吉西他滨组相比,G0/G1期细胞比例明显减低,S期细胞比例明显增加（P＜0.05）。5.IL-10组凋亡率与对照组比较变化较小,GEM组凋亡率明显升高,IL-10+GEM组凋亡率明显低于GEM组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。IL-10显著抑制了吉西他滨的促凋亡作用。6.对于YT细胞和NK-92细胞,对照组和IL-10组中ABCG2、ABCC5和P-gp的表达均无变化,但在GEM组和IL-10+GEM组中,ABCG2、ABCC5和P-gp的表达水平显著降低。对于NK-92细胞,GEM组和IL-10+GEM组中ABCC5的表达增加,但对于YT细胞,ABCC5的表达减少。对于YT细胞和NK-92细胞,GEM组中ABCC4的表达均降低,但在IL-10组和IL-10+GEM组中,其表达显著增加。7.对于 YT 和 NK-92 细胞,IL-10 组中 STAT1、p-STAT1、Tyk2 和 p-Tyk2的表达显著增加,而GEM组中STAT1、p-STAT1、Tyk2和p-Tyk2的表达显著降低,IL-10+GEM 组中 STAT1、p-STAT1、Tyk2 和 p-Tyk2 的表达高于 GEM 组。在IL-10组、GEM组和IL-10+GEM组中,STAT3的表达显著增加。YT细胞,IL-10和IL-10+GEM组,p-STAT3的表达降低,但在GEM组中p-STAT3表达增加;对于NK-92细胞,IL-10组p-STAT3表达降低,GEM与IL-10+GEM组表达均升高。IL-10组JAK1和p-JAK1较对照组略有降低,GEM组和IL-10+GEM组JAK1和p-JAK1表达显著降低,两组间无显著差异。。结论:1.低浓度IL-10一定程度上诱导了 YT及NK-92对吉西他滨的耐药。2.IL-10刺激下,吉西他滨阻滞细胞周期和促进细胞凋亡的作用均被减弱。3.IL-10对YT及NK-92细胞耐药性的影响由ABCC4介导。4.IL-10通过调控JAK/STAT信号通路诱导YT及NK-92细胞对吉西他滨的耐药性。第三章 IL-10对动物体内结外NK/T细胞淋巴瘤耐药性的研究目的:采用BALB/c裸鼠构建YT裸鼠荷瘤模型,通过给予IL-10和吉西他滨刺激,进一步在体内研究IL-10对ENKTL吉西他滨耐药的作用和相关耐药蛋白的表达。材料与方法:1.用YT细胞构建荷瘤裸鼠动物模型。2.将16只荷瘤裸鼠分为4组,空白对照组给予生理盐水腹腔注射,IL-10组裸鼠给予IL-10 50ug/kg*2d尾静脉注射,GEM组裸鼠给予GEM 15mg/kg腹腔注射,每三天给药一次,IL-10+GEM组同时给予IL-10和GEM注射。观察各组肿瘤生长情况。4.Western Blot检测肿瘤组织内ABCG2、ABCC4、ABCC5、P-gp的表达。结果:1.与空白对照组相比,IL-10组的裸鼠肿瘤生长无明显变化（P＞0.05）,GEM组的裸鼠肿瘤生长明显减慢（P＜0.05）,而IL-10+GEM处理后的裸鼠肿瘤较GEM组明显的生长增快（P＜0.05）。2.与空白对照组相比,IL-10组瘤体重量降低不明显（P＞0.05）,GEM组瘤体重量明显降低（P＜0.05）,而IL-10+GEM组的瘤体重量较GEM组却明显增加（P＜0.05）。3.ABCG2、ABCC5和P-gp在空白对照组和IL-10组表达量没有变化,而在GEM组和IL-10+GEM组表达量明显降低;ABCC4在GEM组表达降低,而在IL-10组和IL-10+GEM组表达量均明显升高。结论:1.IL-10可刺激裸鼠对吉西他滨耐药。2.IL-10刺激裸鼠对吉西他滨耐药的作用由ABCC4介导。