小麦作为世界上分布最广泛、种植面积和产量最大的粮食作物之一,其加工成品最为丰富,在现代农业发展中具有重要地位。然而小麦属于甜土作物,耐逆性比较差,随着水资源的日益匮乏以及土地盐碱荒漠化的日趋严重,众多非生物胁迫例如高盐、干旱等对小麦产量的增加及品质的提高造成了很大的负面影响。因此,分离和鉴定新的抗逆基因,利用常规技术和现代生物技术培育抗逆和高产小麦新种质或新品种是今后我国小麦育种的重要方向。从本实验室前期构建的小麦渐渗系耐盐新品种山融3号(SR3)的抗盐芯片数据中发现甲硫氨酸亚砜还原酶(MSR)家族部分成员可能参与了抗逆响应。本研究以克隆自小麦SR3的甲硫氨酸亚砜还原酶TaMSRA4.1基因为研究对象,前期的研究基础表明TaMSRA4.1基因具有MSRA基因的典型特点;其表达产物定位于叶绿体;表达分析发现其在根、茎和叶中均表达,叶中表达量最高;转化拟南芥表明其过表达增加了拟南芥的抗盐性。在此基础上,本论文进一步研究了其在小麦中的作用及其应对非生物胁迫盐和旱的机制,主要研究内容及结果包括:1.TaMSRA4.1分子结构特征及酶学性质分析前面的研究基础表明TaMSRA4.1和其它高等植物来源的MSRA4在序列上高度相似,其分子序列也存在三个保守的功能结构域。本论文进一步对TaMSRA4.1的体外酶学性质进行了实验,结果发现TaMSRA4.1特异性的识别S-型甲硫氨酸亚砜,属于MSRA家族成员。利用qRT-PCR技术对TaMSRA4.1基因在NaCl和PEG等胁迫下的表达模式进行了分析,发现TaMSRA4.1在NaCl、PEG、ABA和H2O2胁迫下表达水平呈现出一定的规律,且能够被这些胁迫所诱导。2.TaMSRA4.1 基因功能分析以扬麦20、TaMSRA4.1转化扬麦20过表达系及拟南芥野生型Col-0、TaMSRA4.1转化拟南芥过表达系及msra4拟南芥突变体等为材料,分别进行了 NaCl和PEG处理观察它们的表型变化。在对照情况下,小麦过表达系和野生型扬麦20并无明显表型差异,但是当进行100 mMNaCl或者10%PEG处理时,小麦过表达系的生长状态明显好于野生型,总根长显著长于野生型,叶片更加坚挺,叶绿素含量也显著高于野生型。对野生型及小麦过表达系进行ROS染色实验,相比于野生型,小麦过表达系在盐旱胁迫下积累更少的ROS,定量分析发现过表达系中H2O2的含量显著低于野生型。对ROS清除相关的酶活进行了测定,结果发现在小麦过表达体中,CAT的酶活显著高于野生型。在拟南芥材料中,我们也发现了相似的表型结果,TaMSRA4.1拟南芥过表达系、野生型及msra4突变体在对照情况下,并无明显表型差异,但是在100 mMNaCl或者200 mM mannitol的处理下,拟南芥过表达系长势明显好于野生型,根长显著增长,而msra4突变体长势却明显弱于野生型。同时,在土壤盐和旱处理条件下进行了成活率实验,结果显示拟南芥过表达系的成活率显著高于其它类型拟南芥,这表明过表达系对盐和旱胁迫有更强的抗性;进行叶片失水率实验,结果表明过表达系叶片有更强的保水性。ROS染色实验发现,在对照情况下,拟南芥过表达系中ROS水平明显低于野生型,H2O2和MDA的含量也显著降低,ROS清除相关的酶SOD,CAT的酶活也显著增高。在盐和旱处理下,这种优势更加明显,而msra4突变体却呈现相反的表型。通过qRT-PCR对ROS通路信号传导通路、ROS合成及清除相关的Marker gene进行了检测,结果表明在拟南芥过表达系中,ROS信号传导通路及ROS的合成相关基因的表达显著下调,而ROS清除酶类基因的表达显著上调。进一步的研究发现,拟南芥过表达系气孔对ABA的敏感性明显高于野生型,气孔开度显著减小。对ABA合成及通路相关Marker gene进行了检测,结果发现ABA的内源合成及下游逆境胁迫响应基因的表达显著上调。对拟南芥和小麦过表达系中ABA的含量进行了检测,结果发现ABA含量显著升高,这表明ABA通路受到了明显的促进。添加ABA特异性抑制剂Norflurazon及构建TaMSRA4.1/aba2遗传株系的表型实验表明,TaMSRA4.1能够分别调控ABA的内源合成及下游逆境胁迫响应基因的表达。3.TaMSRA4.1基因作用机制分析通过生物信息学预测分析发现,在多种小麦近缘物种和大豆中,血红素加氧酶HO1均被预测为MSRA4的潜在的互作蛋白。我们对小麦血红素加氧酶TaHO1进行了克隆及基因结构分析,结果发现该蛋白一级结构分为可变区(VD区)及HemeDomain(Heme区),蛋白中富含Met残基(2.4%),并且多为表面分布,符合MSR底物的特点,通过酵母双杂、BiFC、Co-IP等实验证明TaMSRA4.1与TaHO1能够互作结合,通过分段酵母双杂实验证明,互作的具体区域为TaHO1的Heme Domain。通过体外底物酶活反应实验表明TaMSRA4.1能够还原氧化型的TaHO1,结果表明TaHO1是TaMSRA4.1的底物。通过将Met转变为Leu,对TaHO1蛋白进行定点突变,构建了 TaHO1 M84L、TaH01 M92L、TaHO1 M218L以及TaHO1 M84/92L4种突变蛋白。通过HOC1氧化及TaMSRA4.1还原实验证明,TaHO1蛋白中第84位及92位Met残基对于维持该蛋白稳定具有重要贡献。药理学表型实验及遗传实验证实,TaMSRA4.1是通过TaHO1来发挥对盐旱胁迫的响应功能的。结合以上结果表明TaMSRA4.1和TaHO1在结构上存在互作关系,在功能上是以TaHO1为底物,并通过TaHO1发挥抗逆作用。在拟南芥材料上进行了 CO相关的添加和抑制表型实验,结果发现,CO作为HO1的重要产物之一,参与到了 TaMSRA4.1对盐旱逆境胁迫的响应过程当中。本研究证明了TaM RA4.在耐逆方面的功能及其作用机制,这将为深入理解小麦耐逆的分子基础提供了新资料,为小麦耐逆育种提供了新的抗逆基因。