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第一部分咬合干扰导致大鼠口颌面部疼痛及组织学变化的实验研究目的：通过单侧咬合抬高建立咬合干扰动物实验模型,了解咬合干扰建立后大鼠口颌面部痛阈的变化和所出现的组织学改变,明确咬合干扰在颞下颌关节紊乱病(temporomandibular disorder,TMD)的作用,进一步探讨咬合干扰引起口颌面部疼痛的外周机制。方法：40只8周龄雄性Wistar大鼠,随机分为5个对照组(每组4只)与5个实验组(每组4只),利用在大鼠右侧下颌第一磨牙上粘固铸造冠的方法建立咬合干扰动物模型。于建立模型后1,3,7,14,28天,用Von Frey尼龙毛测量双侧咬肌和颞下颌关节(Temporomandibular joint, TMJ)的疼痛分值,然后分批处死,每组取3只大鼠的双侧咬肌和TMJ滑膜在光镜观察HE染色组织学的改变,并通过免疫荧光技术检测咬肌结蛋白表达量的改变。每组的另1只大鼠取双侧咬肌和TMJ滑膜在电镜下观察超微结构的改变。结果：1.建模后,实验大鼠的双侧咬肌和TMJ的疼痛阂值均发生改变。痛觉过敏持续了整个实验过程。在整个实验过程中,实验组的干扰侧和非干扰侧的疼痛分值在建模后各时间点均高于基准线和对照组,其差异具有统计学意义(p<0.05),但是干扰侧与非干扰侧的疼痛分值之间未见明显差异(p>0.05)。在实验组大鼠的双侧咬肌和TMJ,疼痛分值于咬合干扰模型建立后呈现出先上升后下降的趋势,建模后第1天疼痛分值开始逐渐升高,TMJ在第3、7天,咬肌在第7天时达到最高峰,之后疼痛分值逐渐下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。2.实验组各组大鼠中,咬肌组织未见明显的炎性细胞浸润。光镜下,在建模立后7、14,28天,咬肌组织小部分区域开始出现肌纤维排列紊乱和中央细胞核；咬肌内结蛋白阳性区域在建模后3天开始出现减少且呈不规则；7天组呈点状分布,部分区域出现结蛋白缺失现象,以后逐渐缓解,28天时接近对照组。电镜下,咬肌细胞在建模后3天可见核膜皱缩,染色质不均匀,7天组出现肌膜模糊不清,染色质边集呈新月状,线粒体及糖原增多,线粒体空泡变性等细胞凋亡初期特征,以后逐渐恢复,28天组接近正常。3.实验组各组大鼠中,TMJ滑膜组织并未表现出明显的炎性细胞浸润。光镜下观察到,7、14、28天实验组大鼠TMJ滑膜表面出现褶皱,滑膜内膜细胞增生,滑膜下间质内血管轻度扩张,数目增多。电镜下,仅在7、14、28天组大鼠双侧TMJ滑膜观察到成纤维细胞内分泌糖原颗粒增多,巨噬细胞细胞膜内膜不清晰。结论：1.实验性咬合干扰可以直接引起TMD的口颌面部的疼痛,可见咬合紊乱是TMD的重要病因之一。2.实验性咬合干扰不能引起咬肌和TMJ炎症性改变,但是可以导致咬肌纤维出现能量代谢障碍,部分细胞凋亡,结蛋白的缺失等损伤以及TMJ滑膜的微创伤。这些口颌面部的微损伤并不是咬合干扰引起的口颌面部疼痛的主要原因,但可以加剧口颌面部的疼痛。第二部分三叉神经节与三叉神经脊束核尾侧亚核内P2X3受体参与咬合干扰所致大鼠口颔面疼痛的作用研究目的：为了进一步探讨P2X3受体在咬合干扰所致口颌面部疼痛中的作用机制,在咬合干扰动物模型建立后,通过观察大鼠口颌面部痛阈改变的情况以及P2X3受体在外周和中枢神经系统中的表达变化,并探究这二者的关系,为探索临床上TMD患者口颌面部疼痛的治疗思路提供研究基础。方法：1.3周龄健康雄性Wistar大鼠6只,随机分为2组,每组3只。采用荧光金(Fluoro Gold, FG)免疫荧光逆行示踪的方法,检测三叉神经节(Trigeminal ganglion, TG)中TMJ和咬肌的传入神经分布情况,2.90只8周龄雄性Wistar大鼠,随机分为5个对照组(每组9只)与5个实验组(每组9只),实验组建立咬合干扰动物模型。于建立模型后1,3,7,14,28天用测量双侧咬肌和TMJ的疼痛分值,然后分批处死,取双侧TG和三叉神经脊束核尾侧亚核(Subnuclei caudalis, Vc)对相关指标进行检测。应用免疫组织化学染色法检测P2X3受体阳性细胞率；用荧光定量PCR (real-time PCR)法检测组织中P2X3受体mRNA的相对表达量,用Western Blot技术检测细胞检测组织中P2X3受体的表达。3.12只8周龄雄性Wistar大鼠,随机分为4组,每组3只,在痛阈最低的时间点2组分别在咬肌和TMJ注射P2X3受体拮抗剂A-317491,剩余2组注射生理盐水,检测注射前后咬肌和TMJ疼痛分值的变化。结果：1.经免疫荧光染色后在大鼠TG内可同时观察到FG和P2X3受体双标的神经元。在TG组织内,有14.4±2.0%的神经元支配TMJ的传入神经,而18.1±2.5%的神经元支配咬肌的传入神经。同时,支配TMJ的TG神经元中有44.1±7.0%表现出P2X3受体免疫阳性,而支配咬肌的TG神经元中有48.5±5.4%表现出P2X3受体免疫阳性。2.建模后,实验组双侧TG组织中小直径神经细胞的P2X3受体阳性细胞比例改变呈先升高后降低趋势,与咬肌和TMJ疼痛分值改变类似。实验组双侧TG组织中小直径神经细胞的P2X3受体阳性细胞比例在建模后第7天到达高峰,差异具有统计学意义(p<0.05)；而实验组双侧Vc组织中P2X3受体阳性细胞比例在第3天即达到高峰,并持续到第7天(p<0.05)。3.建模后在实验组的双侧TG组织中,P2X3受体mRNA的相对表达量均高于对照组,并在第3天时差异具有统计学意义(p<0.05)。在实验组双侧Vc组织中,P2X3受体mRNA的相对表达量从建模后第1天开始即显著升高,之后逐渐降低,且在建模后的第1,3,7天与对照组相比较差异具有统计学意义(p<0.05)。4.建模后Western blot结果显示,实验组双侧TG组织中P2X3受体与对照组相比未见明显升高(p>0.05)。从建模后3天开始,实验组动物双侧Vc组织中P2X3受体相对表达量与对照组呈现明显升高(p<0.05),7天时达到峰值,之后相对表达量略有下降,但仍高于对照组。而干扰侧与非干扰侧之间的差异无明显统计学意义(p>0.05)。5.在注射P2X3受体拮抗剂A-317491和生理盐水后,注射A-317491的大鼠颞下颌关节疼痛分值显著低于注射生理盐水组,结果具有统计学差异(p<0.05)。结论：1.P2X3受体广泛存在于三叉神经节及其对咬肌及TMJ的分支中,TG和Vc内的P2X3受体参与咬合干扰所致的口颌面部疼痛传导的外周和中枢神经系统敏化机制。2.P2X3受体选择性抑制剂A-317491可有效的逆转了咬合干扰所致的口颌面部的疼痛反应,可为探索临床上治疗TMD口颌面部疼痛的新方向提供研究基础。