实践及研究表明,急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)的发病机制是个复杂的、多因素参与的病理生理过程,其发病机制至今尚未完全阐明。新近提出的“炎症介质或细胞因子学说”和“钙超载学说”是近年关注的热点,在这些学说中有何种机制发挥重要作用呢?本课题组的前期动物实验表明ghrelin在大鼠AP胰腺组织中表达增高,且其表达水平随着AP病情程度的加重而增加[1]。既往已有动物实验研究证实外源性给予ghrelin可以减少AP炎症介质和炎症因子的释放,也可以引起胰腺腺泡细胞内钙离子增高。由于ghrelin的广泛分布及其所具有的多种生物学功能,我们推测内源性ghrelin在AP的发生发展中可能发挥了重要作用,而其作用机理是否与此类似?本文拟对此展开研究。第一部分体外急性胰腺炎胰腺腺泡细胞模型构建及细胞模型内ghrelin的表达目的：应用雨蛙肽或脂多糖诱导大鼠AR42J胰腺腺泡细胞,以构建体外AP胰腺腺泡细胞模型；研究ghrelin在正常AR42J细胞以及在雨蛙肽诱导AR42J细胞构建的AP胰腺腺泡细胞模型内的表达情况。方法：应用不同浓度雨蛙肽(0,10-8,10-7,10-6mol/L)或脂多糖(0,1,10,100mg/L)刺激大鼠AR42J细胞24h,采用底物酶法测定细胞上清液淀粉酶含量,RT-PCR方法测定细胞内核转录因子B (nuclear factor kappa B, NF-kB)p65、磷酸化IkB-α、L型钙通道(L-type calcium channel, Cav1.2,Cav1.3)、P/Q型钙通道(P/Q-type calcium channel, Cav2.1)、N型钙通道(N-type calcium channel, Cav2.2)、T型钙通道(T-type calcium channel,Cav3.1, Cav3.2)、 ghrelin mRNA表达水平,Western Blot方法测定细胞内NF-kB p65、磷酸化IkB-α、Cav1.2、Cav1.3、ghrelin蛋白表达水平,Elisa方法测定细胞培养上清液白介素(interleukin, IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)蛋白表达水平,Fluo-4-am钙离子荧光探针联合激光共聚焦扫描显微镜测定细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)。结果：1.不同浓度雨蛙肽或脂多糖干预AR42J细胞24h后,细胞培养液上清中淀粉酶含量与对照组相比无显著差异(P＞0.05)。2.与对照组相比,不同浓度雨蛙肽作用24小时后,AR42J细胞NF-kB p65、IKB-α, Cav1.2、 Cav1.3、Cav2.1、Cav3.1、Cav3.2mRNA (F=9.259,15.370,19.189,14.735,42.459,23.000,16.63, P<0.05)及NF-kB p65、IkB-α、Cav1.2、Cav1.3蛋白表达水平(F=7.325,11.341,7.862,42.616,P＜0.05)均明显增高；部分因子组内比较(NF-kB p65、Cav1.3、Cav2.1、Cav3.2mRNA及NF-kB p65、 IkB-α、Cav1.2、Cav1.3)呈剂量依赖性增高(P<0.05), Cav2.2mRNA表达无明显变化(F=2.121,P=0.138＞0.05)；不同浓度脂多糖作用24小时后的AR42J细胞上述基因mRNA表达水平均无明显变化(F=0.552,0.174,0.491,0.182,0.185,0.509,0.125,0.350,P＞0.05)。3.不同浓度雨蛙肽作用24小时后,AR42J细胞培养上清液中IL-1β、IL-6蛋白表达水平较对照组均明显增高,并呈剂量依赖性(F=102.185,349.787,P＜0.05)；不同浓度脂多糖对上述炎症因子蛋白表达无显著影响(F=1.720,0.514;P=0.203,0.679>0.05); Elisa检测各组AR42J细胞TNF-a的OD值过低,无法计算出相应的蛋白浓度。4.不同浓度雨蛙肽作用24小时后,AR42J细胞内[Ca2+]i较对照组均显著增高,且不同浓度雨蛙肽组间[Ca2+]i比较呈剂量依赖性增高(F=421.939,P＜0.05)。5.雨蛙肽处理组AR42J细胞ghrelin mRNA和蛋白表达水平较对照组明显升高(F=45.128,67.2358,P＜0.05),并呈剂量依赖性(P<0.05)。结论：1.雨蛙肽和脂多糖刺激AR42J细胞前后,细胞培养上清液淀粉酶无明显变化；2.雨蛙肽刺激能引起AR42J细胞多种炎症因子和钙通道基因mRNA、蛋白表达水平以及[Ca2+]i升高,提示AP胰腺腺泡细胞模型构建成功；3.脂多糖刺激对AR42J细胞多种炎症介质和钙通道基因mRNA及蛋白表达无显著影响；4. ghrelin在大鼠胰腺腺泡细胞AR42J中存在高表达,雨蛙肽刺激AR42J细胞后ghrelin mRNA和蛋白表达水平较对照组升高。第二部分ghrelin miRNA慢病毒干扰载体的构建、筛选及对AR42J细胞的靶向干扰效果目的：筛选有效的大鼠ghrelin miRNA序列,构建ghrelin miRNA慢病毒载体；应用构建的慢病毒ghrelin miRNA载体转染AR42J细胞,观察其对细胞内ghrelin基因表达的抑制情况。方法：1.针对ghrelin基因构建四个干扰质粒：pcDNATM6.2-X207-1-3, pcDNATM6.2-X207-2-1, pcDNATM6.2-X207-3-1, pcDNATM6.2-X207-4-1;构建高表达载体pCDNA3.1(+);干扰载体和高表达载体共转染HEK293细胞,qPCR检测目的基因的表达情况,筛选出最佳干扰载体X207-1-3；使用BP重组系统和LR重组系统将目的片段从miRNA载体重组到慢病毒载体pLenti6.3/v5DEST上,筛选阳性克隆并测序验证；用构建的慢病毒表达载体pLenti6.3-X207-1和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度。2.将AR42J细胞分为5组：空白对照组、阴性对照组(MOI=100)、ghrelin-miRNA A组(MOI=50)、ghrelin-miRNA B组(MOI=80)、 ghrelin-miRNA C组(MOI=100)；应用RT-PCR和Western Blot方法分别检测各组细胞内ghrelin mRNA和蛋白的表达水平。结果：1.qPCR检测4个miRNA序列对ghrelin基因的沉默效应,其中以pcDNATM6.2-X207-1-3下调最为明显(86%)。2.选择沉默效应最明显(86%)的序列包装慢病毒,病毒滴度为1×108TU/ml。3. ghrelin miRNA能被重组慢病毒高效地转染入AR42J细胞,转染效率高达80%,RT-PCR和Western Blot结果显示靶基因慢病毒转染C组(MOI=100)细胞内ghrelin mRNA和蛋白表达的干扰效果最明显(P＜0.05)。结论：成功构建慢病毒ghrelin miRNA载体,并包装出高滴度病毒,为后续实验奠定基础；构建的慢病毒ghrelin miRNA载体可以有效沉默AR42J细胞内的ghrelin基因。第三部分靶向干扰ghrelin基因对急性胰腺炎胰腺腺泡细胞炎症通路及钙通路的影响目的：研究靶向抑制ghrelin表达对雨蛙肽刺激AR42J细胞构建的AP胰腺腺泡细胞模型内炎症通路及钙通路的变化。方法：1.将AR42J细胞分为4组：空白对照组、雨蛙肽组、阴性对照+雨蛙肽组、ghrelin-miRNA+雨蛙肽组。2.应用RT-PCR和Western Blot方法分别检测各组细胞内NF-kB p65、磷酸化IkB-α、Cav1.2、Cav1.3. Cav2.1mRNA及蛋白的表达,Elisa方法检测各组细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的表达。3. Calcium CrimsonTM, AM钙离子荧光探针标记联合激光共聚焦扫描显微镜测定各组[Ca2+]i。结果：与雨蛙肽组和阴性对照+雨蛙肽组相比,ghrelin-miRNA+雨蛙肽组AR42J细胞：NF-KB p65、磷酸化IKB-αmRNA表达水平(F=51.255,9.266；P<0.05)和蛋白表达水平显著升高(F=7.533,18.876；P<0.05),细胞上清液IL-1β、IL-6蛋白表达水平显著升高(F=334.554,336.462；P＜0.05)；Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1mRNA表达水平(F=37.208,55.651,42.640；P<0.05)及Cavl.2、Cav1.3蛋白表达水平明显降低(F=6.894,64.239; P<0.05);[Ca2+]i明显降低(F=61.358,P<0.05)。结论：靶向抑制AP胰腺腺泡细胞内ghrelin基因的表达,一方面可以上调细胞内炎症因子的表达,另一方面可以减轻其细胞内钙超载。第四部分全基因组基因芯片分析靶向干扰ghrelin基因对急性胰腺炎胰腺腺泡细胞基因表达谱特征的影响目的：筛选靶向抑制ghrelin表达的AP胰腺腺泡细胞内基因表达差异,并进一步分析相关信号通路,以探讨其分子生物学机制。方法：1.将AR42J细胞分为2组：ghrelin-miRNA+雨蛙肽组、阴性对照+雨蛙肽组。2.实验干预后收集细胞提取RNA,并进行RNA质量鉴定。将总RNA合成为ds-DNA后进行标记,并与NimbleGen大鼠全基因组基因芯片杂交,运用Axon GenePix4000B基因芯片扫描仪进行扫描。3.所有基因水平文件输入Agilent GeneSpring GX11.5.1软件进行聚类分级,进一步进行GO分析和通路分析。结果：1. NimbleGen全基因组基因芯片筛选出ghrelin基因沉默及雨蛙肽诱导的AR42J细胞差异表达基因上调或下调2倍以上基因共2938个,其中表达上调基因1435个,表达下调基因1503个。2.GO分析结果显示差异表达基因在biological process分类中,与各种代谢过程相关的基因出现最多,其次为生物调节、进化过程、细胞过程调节等；在cellular component分类中,改变最为显著的差异表达基因主要位于细胞及细胞内部分、细胞核、膜型细胞器等细胞成分中；在molecular function分类中,与结合相关的基因差异最多,包括蛋白结合、金属离子结合、阳离子结合、核苷酸结合、小分子结合等。3. Pathway分析结果显示表达上调基因涉及31个信号通路,表达下调基因涉及30个信号通路。4.通过筛查与炎症和钙通路相关的差异表达基因,结果显示,与CAMP/Ca2+信号通路相关的差异表达基因有60个,与炎症通路相关的差异表达基因有199个。结论：通过芯片结果、Pathway及GO分析等初步筛查发现：ghrelin对AP胰腺腺泡细胞的作用机制可能与细胞内代谢过程及离子、蛋白等结合功能有关；相关通路可能包括MAPK信号通路、细胞间粘附分子信号通路、焦点连接、Wnt信号通路、P53信号通路等。