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先天性心脏病（Congential heart disease,CHD）是常见的新生儿先天性畸形,近年来先心病发病呈上升趋势。约90%的先心病属于多基因病,多基因病的遗传因子和环境因子的性质相当复杂。某些高发家系仅仅是由单个基因座位与个别环境因子相互作用所致,而大多数散发型先心病是由多个基因座位的微小效应叠加在一起相互作用引起的,散发型非高发家系的先心病患者又占多基因遗传的90%以上,因此对散发型先心病发病机制研究更为重要。目前先心病的研究主要集中于从部分基因座位着手揭示多基因的分子病理机制。模式生物研究证实心脏转录因子功能异常可导致严重的先心病,其基因突变成为目前先天性心脏病发病机制研究的焦点。多基因疾病发生过程中参与的遗传因素存在明显的地区差异和种族差异。最早发现的心脏特异性同源盒转录因子NKX2.5（Homobox transcription factor,NKX2.5）基因国外人群共发现29种突变,突变率约4%。国内人群Li Tian在一个房间隔缺损家系中发现NKX2.5基因3个错义突变,而散发型先心病中至今仅孙淼发现了一个三碱基的缺失。国外人群研究GATA4基因突变率仅为约2%,而中国汉族人群唐朝晖在31例患者中却发现了两个新的错义突变Val267Met、Val380Met。提示中国汉族人群先天性心脏病患者转录因子基因突变检测率及突变位点可能与国外人群不同。CITED2基因（cAMP-responsive element-binding protein,CBP/p300）cAMP应答元件结合蛋白基因是转录激活因子家族中新发现的成员之一,目前发现的3种突变均集中于编码链的丝氨酸-甘氨酸富含区（serine-glycine-rich junction SGJ）序列。本课题拟研究散发型先心病患者与瓣膜缺损相关的NKX2.5、GATA4、CITED2基因,了解中国汉族人群中的先心病突变位点及分布情况,并进一步分析基因型与表型间的关系。先心病由环境因素和遗传因素相互作用引起,即遗传易感性和环境致畸原的相互作用是先心病的发病原因。既往研究认为孕期母亲暴露于先心病高危因素会增加子代先心病风险,所以本研究还回顾性探讨孕期父母暴露因素与叶酸补充情况,了解叶酸补充与孕母自身叶酸代谢酶5,10亚甲基四氢叶酸还原酶基因（methylenetrahydrofolate reduclase gene,MTHFR）C677T基因型之间的交互作用,并比较病例组父代及对照组父代突变等位基因频率,分析其对子代发病的风险。第一部分散发型先天性心脏病NKX2.5、GATA4、CITED2基因突变检测第一节NKX2.5基因在散发型先天性心脏病中的突变检测目的:研究中国人群散发型先天性心脏病NKX2.5基因编码链突变。方法:收集135个散发型先天性心脏病患者和114例正常健康新生儿血液进行DNA抽提、PCR扩增NKX2.5基因的编码链,应用变性高效液相色谱仪（Denaturing high performance liquid chro matography DHPLC）检测并DNA测序验证突变。结果:在室间隔缺损病人中发现一种新的错义突变,编码链第848位碱基C转换为A,导致283位密码子由CCG转换为CAG,编码的氨基酸由脯氨酸转换为谷胺酰胺（p.Pro283Gln）,这种突变对照组未检测到。发现两种已报道单核苷酸多态性rs2277923和rs3729753,分别导致第21位密码子GAG转变为GAA和第303位密码子CTG转变为CTC,均为同义突变。基因型频率及等位基因频率与以往报道相同,两组没有差异。既往报道的33种突变位点本研究中未检测到。结论:NKX2.5基因Pro283Gln突变位点可能是室间隔缺损患者的发病原因之一。第二节GATA4基因在散发型先天性心脏病中的突变检测目的:检测中国汉族人群散发型先天性心脏病患者GATA4基因编码链突变。方法:应用PCR—DHPLC对135例散发型先天性心脏病患者和114例健康对照组进行GATA4基因编码序列的突变检测,对异常峰型PCR产物进行直接测序验证。结果:发现两个新的错义突变和三个新的单核苷酸多态性位点。错义突变分别是在散发型VSD患者中发现的位于exonl的Pro163Ser,和散发型TOF患者位于exon6的Pro407Gln,对照组中均未检测到。位于编码链的新的核苷酸多态性位点Ala33Ala系同义突变。内含子区域检测到两个SNP改变。比较SNP基因型频率及等位基因频率病例组及对照组均没有显著性差异。结论:GATA4基因错义突变可能是中国人群室间隔缺损和法洛氏四联症的发病原因之一。GATA4基因突变可能多存在于中国散发型先心病患者而且对应先心病表型呈多样化。第三节GITED2基因在散发型先天性心脏病中的突变检测目的分析先天性心脏病（congenital heart defects,CHD）患者的CITED2基因编码链基因突变的情况。方法收集101例散发型CHD患者和104例正常健康新生儿血液进行DNA抽提、PCR扩增,应用DHPLC进行CITED2基因全部编码序列的突变检测,对有异常峰型的DNA进行直接测序,并与GeneBank进行比较。结果首次在动脉导管未闭的患者发现CITED2基因的一种新的插入突变,在CITED2基因编码链碱基483位起始处插入一个重复9肽（c483484ins27）,导致蛋白的丝氨酸—甘氨酸富含区（SGJ）插入9个氨基酸p.Ser161-Gly162ins9。对照组中未检测到此突变。在CITED2基因的EP300结合基序未发现突变。结论中国先心病患者中存在CITED2基因突变,新发现的CITED2基因的重复9肽插入突变c483484ins27可能是导致动脉导管未闭发生的原因之一。第二部分先心病患者父代NKX2.5、GATA4、CITED2基因突变检测目的研究患者父代NKX2.5、GATA4、CITED2基因编码链的突变情况,了解患者父代基因突变或SNP对子代先心病发病风险的影响。方法收集137例散发型CHD患者父亲或母亲和114例正常健康对照组父母血液进行DNA抽提、PCR扩增,应用DHPLC检测NKX2.5、GATA4、CITED2基因全部编码链的突变情况。对有异常峰型的DNA进行直接测序。结果在法洛氏四联症患者（33）无先心病的父亲血液基因组中发现与患者相同的Pro163Ser突变。6个SNP位点患者父代中均存在,NKX2.5基因rs2277923多态性位点父代与子代基因型组合发现父代杂合型/子代野生型及父代野生型/子代杂合型较父代野生型/子代野生型后代有更大风险获得先天性心脏病（P＜0.05）结论患者未患先心病的一级亲属中也可以存在GATA4基因Pro163Ser基因突变位点。第三部分孕期环境高危因素与MTHFR基因C677T多态性对子代先心病发病风险研究目的分析孕母孕早期环境高危因素,探讨叶酸摄入与MTHFR基因多态性间交互作用对先心病发病的影响。方法通过病例对照研究回顾性分析98例先心病患者母亲和101例正常对照组母亲孕期危险因素暴露水平,及叶酸及复合维生素摄入情况,并进一步应用DHPLC检测MTHFRC677T多态性了解与叶酸摄入的交互作用。结果Logistic回归分析有6项因素纳入先心病风险模型,孕母教育程度、没有定期产检、精神紧张、接触化学物质是子代先心病的高危因素,服用叶酸和复合维生素是先心病的保护因素。三种基因型对照组摄入叶酸情况均与病例组有显著差异（P＜0.05）。每天服用叶酸情况下,MTHFR基因各基因型比较病例组与对照组无统计学差异。仅间断服用叶酸组较未服用叶酸组各基因型比较差异无统计学意义,合并有时服用及未服用叶酸比较孕母基因型为CT与CC时发病相对风险,P值为0.087,OR值为2.018（0.95-4.285）。结论提高孕母的自我保健意识是减少先心病危险因素暴露的重要措施。怀孕早期孕母叶酸的补充不足可能是导致子代先心病发病风险增高的独立因素,孕母MTHFR基因C677T基因型合并叶酸补充不足可能增加先心病风险。