布鲁氏菌病是目前最为常见的动物疾病,可感染多种动物,在全球范围内广泛流行。这种疾病的感染可导致动物流产、消瘦,严重时可致动物死亡。其严重的临床症状及其流行特性,对国内外的养殖业造成了严重的经济危害,引起了国内外学者的广泛关注。接种疫苗是目前国际公认的预防动物疫病的最佳方法。市面上通用的布鲁氏菌疫苗主要为减毒活疫苗,包括S2、S19、M5、104M等。但近年来,动物感染布鲁氏菌的案例屡见不鲜,故本实验利用布鲁氏菌的L₇/L₁₂基因、Omp31基因及其融合基因L₇/L₁₂-Omp31构建重组卡介苗,以期预防布鲁氏菌病,为新型疫苗的研制做出有益的探索和尝试。1重组卡介苗rBCG-L₇/L₁₂、rBCG-Omp31、rBCG-L₇/L₁₂-Omp31的构建将卡介苗表达基因19kDa信号肽插入整合表达载体pMV361中,构建可将外源基因在卡介苗表达的新型重组载体pMV361L。之后将L₇/L₁₂基因、Omp31基因及L₇/L₁₂-Omp31融合基因通过同源重组方法分别插入到重组载体pMV361L中,共构建了三种重组整合表达质粒,分别命名为pMV361L-L₇/L₁₂、pMV361L-Omp31、pMV361L-L₇/L₁₂-Omp31。将三种整合表达质粒电转入卡介苗感受态中,经过抗酸染色及菌液PCR验证,表明整合表达质粒已成功转入卡介苗中,分别命名为rBCG-L₇/L₁₂、rBCG-Omp31、rBCG-L₇/L₁₂-Omp31。将鉴定正确的三种阳性重组卡介苗通过热诱导的方式表达出相应的目的蛋白,提取总蛋白并作Western Blot鉴定,结果显示,目的蛋白大小与预期大小相同。2重组卡介苗rBCG-L₇/L₁₂、rBCG-Omp31、rBCG-L₇/L₁₂-Omp31的免疫原性研究将三种重组卡介苗分别在第0天、14天、28天经腹腔免疫小鼠,并于免疫后第14天、28天、42天、56天,各组分别取三只进行眼球采血,取血清做抗体效价检测及细胞因子检测。免疫第56天时,取脾淋巴细胞,通过脾淋巴细胞增殖及T淋巴细胞亚群含量的测定综合评价小鼠的体液免疫和细胞免疫水平。抗体检测结果表明,重组卡介苗组均能产生不同程度的抗布鲁氏菌的特异性抗体;体外淋巴细胞增殖试验表明,重组卡介苗组的增殖效果高于对照组,融合基因组的增殖效果高于单一基因组,且运用S2菌液进行特异性刺激时,明显高于ConA刺激的效果,重组卡介苗能够诱导小鼠产生细胞免疫应答;T淋巴细胞亚群含量测定结果显示,重组卡介苗组的CD4⁺/CD8⁺比值均高于PBS组,表明重组卡介苗诱导的免疫反应主要以CD4⁺免疫为主。而细胞因子的检测结果表明,重组卡介苗能够诱导小鼠体内产生Th1型及Th2型免疫反应,且以Th1型反应为主导。另外,在整个免疫过程中,融合基因的重组卡介苗免疫效果高于单一基因重组卡介苗。本实验将布鲁氏菌L₇/L₁₂和Omp31基因融合后共同插入pMV361L表达载体,电转至卡介苗中实现共表达,对构建的重组卡介苗进行免疫试验研究。这将为研制出有效预防布鲁氏菌病的基因工程疫苗做出有益的探索和尝试。