中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)是2012年在中东地区发现的一种新型冠状病毒,随后该病毒从中东地区向外传播。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)报道,截止到2016年4月26日,全球共有27个国家1728例实验室确诊病例,其中死亡624例,病死率高达36.1%。然而,目前尚无特异性药物治疗该病毒引起的感染。因此,丞待开发一种安全有效的疫苗预防或治疗该病毒引起的疾病。MERS-CoV为包膜病毒,其包膜上的棘突蛋白(Spike, S)在介导病毒与宿主细胞膜结合以及病毒进入细胞过程中发挥重要作用。S分为S1和S2两个亚单位,前者介导病毒和易感细胞上的受体结合,后者在病毒包膜和宿主细胞膜融合中发挥作用。S1进一步分为N端结构域(N terminal domain, NTD)和C端的受体结合结构域(Receptor binding domain, RBD)。RBD蛋白介导MERS-CoV与宿主细胞膜上的二肽基肽酶4(Dipeptidyl peptidase-4, DPP4)分子结合,富集中和性抗原表位,是MERS-CoV疫苗研发最重要的靶抗原。亚单位疫苗是预防病毒感染的重要手段,本文应用重组RBD或NTD蛋白作为亚单位疫苗,先后在小鼠或恒河猴体内检测了其诱导的免疫应答反应和免疫保护效果。同时构建了基于S蛋白的MERS-CoV嵌合型病毒样颗粒(Virus like particles, VLPs)疫苗,并在小鼠体内检测了该VLPs的免疫原性。具体研究内容及结果如下：1、重组RBD蛋白疫苗在小鼠体内免疫效果研究重组RBD蛋白与不同佐剂(单独铝佐剂、铝佐剂和CpG联合、铝佐剂和poly(I:C)联合)经肌肉注射,或与CpG和不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund’s adjuvant, IFA)联合应用经皮下注射,可在BALB/c小鼠体内诱导不同水平RBD特异性IgG抗体、中和抗体以及全身或局部细胞免疫应答反应。其中,重组RBD蛋白在铝佐剂和CpG联合作用下、经肌肉注射可在小鼠体内诱导最高水平的体液免疫应答,且该免疫策略可诱导多种效应性细胞因子的分泌。病毒攻击实验表明,该策略可在小鼠体内诱导有效的免疫保护反应,减轻MERS-CoV攻击后小鼠肺脏和气管组织的炎症反应。2、重组RBD蛋白疫苗在恒河猴体内免疫效果研究高(200μg)、低剂量(50μg)重组RBD蛋白疫苗肌肉注射三次免疫恒河猴后,在其体内诱导了强大而持久的体液免疫应答(IgG抗体和中和抗体)。高剂量组重组RBD蛋白疫苗还诱发了有效的细胞免疫应答。末次免疫后2w,恒河猴气管内接种6.5×107TCID50 MERS-CoV。结果发现,与对照组相比免疫恒河猴肺部炎症反应较轻、肺脏和气管病理改变轻微、肺组织MERS-CoV病毒载量和病毒滴度均较低。表明该重组RBD蛋白疫苗在恒河猴体内诱导了有效的免疫保护反应。3、重组NTD蛋白疫苗在小鼠体内免疫效果研究重组NTD蛋白在铝佐剂和CpG联合作用下、经肌肉注射三次免疫BALB/c小鼠。结果发现,该重组NTD蛋白疫苗在小鼠体内除诱导了中和抗体(水平略低于重组RBD蛋白疫苗)外,还诱导了高水平的细胞免疫应答(强度显著高于重组RBD蛋白疫苗)。该体液和细胞免疫应答在小鼠体内至少持续14w而无明显下降。MERS-CoV攻击后,病理结果示,虽然攻毒后的小鼠肺部出现炎症改变,但较对照组明显减轻,且该免疫保护水平与重组RBD蛋白疫苗相当。4、VLPs疫苗的研制及免疫原性分析以禽流感病毒H5N1的基质蛋白M1为骨架,在其表面嵌合MERS-CoV的S蛋白,应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中包装了MERS-CoV嵌合型VLPs。该VLPs在电镜下与MERS-CoV相似,呈球形,直径约100nm左右,具有典型的包膜以及“皇冠”样外观。该VLPs疫苗与铝佐剂和CpG联合应用、经肌肉注射免疫BALB/c小鼠后,可在其体内诱导S蛋白特异性IgG抗体,且抗体滴度与灭活MERS-CoV疫苗相当。此时血清亦检测到中和抗体,但抗体滴度低于灭活MERS-CoV疫苗免疫组。以上研究表明,本研究成功构建了有免疫原性的MERS-CoV嵌合型VLPs。综上所述,本研究在小鼠或恒河猴体内评价了重组RBD和NTD亚单位疫苗预防MERS-CoV感染的效果,结果表明该两种亚单位疫苗均在动物体内诱导了有效的免疫应答和明显的免疫保护效果。应用流感病毒M1为骨架,表面嵌合MERS-CoV S蛋白,成功构建了嵌合型VLPs疫苗。该VLPs疫苗在小鼠体内诱导了高水平的体液免疫应答反应。这些研究为MERS-CoV疫苗的研发以及人体应用奠定了理论基础。