细胞表面受体是一类能够介导细胞内外信号传递的蛋白,受体的空间聚集在控制一些细胞生物学过程（例如细胞增殖、分化、迁移和凋亡）中起至关重要的作用。近年来,研究人员已开发多种基于DNA纳米结构诱导受体寡聚化的策略,用于调控细胞行为的研究。例如,基于DNA折纸技术构建的DNA纳米卡尺,通过控制Ephrin-A5的空间分布调节了乳腺癌细胞的迁移。然而这些方法多是直接在载体结构上修饰不同密度的多价配体以影响受体聚集程度,目前仍然缺少通过响应体内生理环境刺激进行细胞功能动态调控的平台。基于此,本课题设计了一种pH驱动的套锁式DNA纳米弹簧（interlocked DNA nano-spring,iDNS）,该结构能够响应体内肿瘤微环境（pH 6.5）刺激发生结构的收缩变化,并进一步调控细胞表面受体聚集以促进细胞的粘附、迁移和增殖行为。具体研究内容如下:1.iDNS的构建与表征首先,利用程序性退火和酶连接反应构建iDNS结构。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳验证单链核酸可通过碱基互补配对组装成为iDNS。iDNS的套锁结构为配体组装提供了刚性支架,可精确控制配体的空间分布。为了考察编码i-motif序列的iDNS结构是否具有pH响应性,我们在iDNS结构上修饰TAMRA和BHQ-2构建荧光淬灭实验,并检测iDNS样品在不同pH反应体系中的荧光强度。结果显示,iDNS在pH 7.4条件下呈明显的荧光信号,而在pH 6.5的微酸性环境下荧光强度下降60%。同时,无pH响应性的对照组荧光强度无明显变化。通过改变溶液pH值,iDNS的荧光强度可反复循环至少5次。原子力显微镜成像显示,将溶液pH值由7.4调至6.5时,iDNS结构发生明显的伸缩变化,其长度由2μm缩短至800 nm,高度由1.4 nm增加至1.8 nm。且iDNS结构上的配体间距从100nm缩短至约37 nm。这证明iDNS结构可以在酸性和碱性环境中执行pH驱动的类弹簧式伸缩运动。2.iDNS-R调控细胞粘附和迁移的研究选择贴壁性较好的HeLa细胞系作为细胞模型,考察修饰了RGD的iDNS-R对细胞粘附和迁移行为的调控能力。凝胶电泳结果验证RGD可以通过链霉亲和素和生物素的相互作用被连接在iDNS支架上制备iDNS-R。利用FITC标记的鬼笔环肽染料进行细胞骨架染色。激光共聚焦显微镜成像（Confocal laser scanning microscopy,CLSM）和伤口愈合实验显示,iDNS-R可以结合在HeLa细胞膜上,并能在细胞膜上保留iDNS结构的pH驱动弹簧收缩功能。在pH 6.5条件下iDNS-R的结构收缩会诱导整合素受体聚集,促使细胞粘附铺展面积由约300μm~2增大到约500μm~2,细胞迁移率由10%提高到40%。这些研究证实了iDNS-R可以实现酸响应刺激促进细胞粘附和迁移行为的能力。3.iDNS-A在体外激活T细胞增殖的研究将anti-CD3和anti-CD28分别作为T细胞非特异性抗原激动剂和辅助受体的共刺激信号连接在iDNS支架上制备iDNS-A。利用CFSE染料标记CD8+T细胞,CLSM和流式细胞实验共同证明了iDNS-A能够锚定在CD8+T细胞膜上,并能在细胞膜上保留该结构的pH驱动弹簧收缩功能。通过流式细胞和细胞计数实验,验证了在pH 6.5条件下iDNS-A的结构收缩会诱导T细胞表面受体形成团簇,并激活T细胞的NF-κB信号通路,促使CD8+T细胞的增殖率由16.8%提高到55.1%,细胞扩增倍数增加4倍。同时酶联免疫吸附分析（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）实验结果显示IFN-γ和TNF-α分泌水平相比对照组分别上调1.5倍和1.2倍。这些结果证实了iDNS-A可以在体外酸性条件下激活T细胞增殖,实现人工调控T细胞行为的作用。4.iDNS-A在体内激活T细胞增殖和抗肿瘤免疫治疗效果的研究构建B16F10荷瘤小鼠模型,用于研究iDNS-A在体内响应肿瘤微环境（pH6.5）后激活CD8+T细胞增殖并抑制肿瘤生长的作用。在两周的治疗周期内,将iDNS-A和BMS-1（PD-1/PD-L1信号通路抑制剂）进行4次瘤内注射给药。通过监测肿瘤体积和小鼠体重、肿瘤组织切片的TUNEL和H＆E染色,验证了iDNS-A可以在体内显示出有效的肿瘤抑制效果,抑瘤率为72.8%。利用肿瘤组织切片免疫荧光染色和流式细胞实验分析得知,iDNS-A可以在体内响应实体瘤中低pH条件促进约12倍的CD8+T细胞扩增,显著增强肿瘤免疫治疗。本研究在细胞和动物实验中验证iDNS可以实现由体内异常病理条件诱导的细胞功能调控,为特异性调节细胞生物学行为的纳米平台在体内应用提供新策略,在细胞疗法的临床应用领域具有发展潜力。