背景与目的：尽管肺癌的化疗、放疗、手术和基因治疗取得了巨大的进步，但肺癌仍是对人类健康威胁最大的恶性肿瘤。因此，研究和开发靶向基因治疗的新方法和新技术，是提高肺癌治愈率和改善患者生存质量和预后的重要措施。近年来，肺癌的基因治疗在临床前研究中取得了较好的治疗效果，但由于在靶组织中目的基因表达效率低，靶向性和可调控性差，副作用大的缺点，而限制了其在临床上的应用。肿瘤细胞或组织特异性基因治疗成为靶向性基因治疗的发展方向。为了探讨转录靶向性KDR基因启动子调控的双自杀基因在肺癌靶向治疗中的作用及效果。 材料与方法：本研究应用基因工程技术构建了转录靶向性KDR基因启动子调控的双自杀基因载体质粒pcDNA3-KDRp-CDglyTK。应用脂质体法将pcDNA3-KDRp-CDglyTK转入KDR基因表达不同的肺癌细胞株(L9981、NL9980)，内皮细胞株(ECV304)和不表达KDR基因的肝癌细胞株(HepG2)，并建立相应的转双自杀基因的细胞株；应用细胞培养技术检测了不同前药对转双自杀基因细胞株的杀伤作用及旁观者效应，同时应用TUNEL法和流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期的变化；动物实验观察联合应用5-FC和GCV对转双自杀基因人高转移肺癌细胞株L9981和NL9980裸鼠体内的成瘤性和L9981细胞株裸鼠皮下种植瘤自发性肺转移的影响。 本课题受国家自然科学基金重点项目(30430300)和中国博士后科学基金(2004035697)资助 结果： 1.应用基因工程技术成功克隆了KDR基因启动子KDRp，经DNA序列分析证明其碱基序列与理论值完全一致，并且其调控目的基因表达的转录活性与CMV启动子相当。转染KDRp-CDglyTK基因的细胞，能接受细胞内与KDR蛋白转录有关的调控蛋白调节，从而指导表达KDR蛋白的细胞特异性地表达双自杀基因。 2.应用RT-PCR和Westernblot方法检测了不同肿瘤细胞株中KDR基因的表达：观察到不同肿瘤细胞株及人脐静脉内皮细胞株中KDR基因的表达水平不同。本研究检测的四株细胞KDR基因表达强度从大到小依次为：ECV304＞L9981＞NL9980，而HepG2细胞中无KDR基因表达。 3.应用质粒DNA的转化、酶切和连接技术成功构建了KDRp调控双自杀基因的真核质粒表达载体pcDNA3-KDRp-CDglyTK。将其导入ECV304、L9981、NL9980和HepG2细胞株，并建立相应的细胞株。PCR检测表明转染KDRp-CDglyTK基因的细胞系中均有双自杀基因的稳定表达。ECV304、L9981、NL9980细胞中均检测到CD和TKmRNA表达，而HepG2细胞中无CD和TKmRNA表达。 4.体外实验结果表明：不同的前药特异性地对表达KDR和双自杀基因的细胞株(ECV304、L9981、NL9980)均有显著的杀伤作用(p＜0.05)。联合用药组(5-FC+GCV)对肺癌细胞株(L9981和NL9980)及血管内皮细胞株(ECV304)的杀伤能力显著高于单独用药组(5-FC和GCV)(p＜0.05)。而对不表达KDR的肿瘤细胞株(HepG2)无明显的细胞毒作用。说明受KDR启动子调控的双自杀基因可靶向的杀伤KDR表达阳性的肺癌细胞株及肿瘤血管内皮细胞株。 5.旁观者效应检测表明：相同混合比例的转染双自杀基因的细胞株，5-FC用药组肺癌细胞(L9981和NL9980)和血管内皮细胞(ECV304)的旁观者效应均显著强于GCV组(p＜0.05)；联合用药组的旁观者效应显著高于单独用药组(p＜0.05)，当转双自杀基因细胞的比例为40％，两药出现显著的协同作用(p＜0.05)。 6.流式细胞仪及TUNEL法的检测结果表明：应用不同的前药处理转染双自杀肺癌株L9981细胞种植瘤的自发性肺转移(p＜0.05)。 结论：①KDR基因启动子不仅在人血管内皮细胞中具有转录活性，在人肺癌细胞株L9981和NL9980中也有转录活性。因此，KDR启动子可用作靶向基因治疗的转录调控子。②KDR启动子可调控双自杀基因在KDR表达阳性的细胞株(L9981、NL9980和ECV304)中稳定表达。③KDRp调控的双自杀基因系统中，联合用药治疗肺癌的效果显著优于单独用药，且联合用药具有显著的协同作用。④KDR基因启动子调控的双自杀基因治疗为肺癌的靶向性基因治疗提供了新的策略和广阔的临床应用前景.