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一.RNA干扰(RNA interference,RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象,它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(double strandedRNA,dsRNA)时,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象,这种现象发生在转录后水平,又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。这种技术已经成为研究基因功能的重要工具,并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。
在我们应用RNA干扰下调某些基因的表达时,沉默效率往往很低。很多报道表明不同的siRNA产生不同得到沉默效率。所以,沉默一个基因需要筛选多个siRNA.目前常用的检测沉默效率的方法有:western blotting,northern blotting,RT-PCR,andimmunodetection,这些方法都比较费时费力。所以我们希望能够发展一种快速检测沉默效率的方法。
我们建立了四环素调控系统,此系统可快速检测沉默效率进而筛选最有效的siRNA。此系统主要由一个我们构建的非常新颖巧妙的质粒载体组成。此载体包括shRNA表达框,GFP表达框及四环素诱导的目的基因与RFP融合蛋白表达框。GFP的荧光密度指示该载体的转染效率,RFP的红色荧光密度变化可指示目的基因的最终沉默效果。所以,不同的siRNA的干扰效率可通过计算RFP/GFP的荧光密度比值来检测。此系统还可以同时沉默内源基因。
二.行为学是生物自身的基因与环境相互作用而产生的结果。对于人类自身来讲,周围环境能够改变行为学,其蕴涵的最重要的机制就是学习记忆过程。学习是我们从外界获取认知的一个过程,而记忆是所获得的认知的编码、存储和以后重新使用的过程。学习过程是如何通过大脑影响行为的?记忆存储的分子机制在进化过程中高度的保守,高级复杂的学习记忆过程的分子机制往往和最简单的低等生物的机制十分类似。通过对一些简单的模式的研究分析,可以折射出高等的哺乳动物中对学习记忆有比较大影响的一些基因,以及它们对学习记忆的调节过程和方式。
线虫在研究行为可塑性方面具有很好的优势,因为它的神经系统特别简单,而且到目前为止都研究的十分清晰。线虫对外界的刺激,比如轻触、味道、温度等等都有很强的感应能力。线虫中的学习记忆包括非联合学习记忆和联合学习记忆。本论文利用几种学习记忆模式及RNAi干扰,初步筛选了与线虫联合学习记忆相关的神经肽。在RNAi实验中,这些神经肽在学习记忆方面有着缺陷。