目的邻苯二甲酸酯类（Phthalate esters,PAEs）是一类广泛暴露于环境且具有人类生殖毒性的环境内分泌干扰物,其对女性生殖毒性的研究已成为备受关注的全球性环境和健康问题,然而其中的具体机制尚未明确。本研究共分为两个部分。第一部分,通过饮食建立DEHP暴露小鼠模型以及体外MEHP胚胎暴露模型,分别探究DEHP在体暴露和MEHP体外暴露是否具有雌性小鼠生殖毒性。第二部分,在确定DEHP和MEHP暴露具有雌性小鼠生殖毒性的基础上,进一步探究具体的作用机制。通过DEHP和MEHP暴露,获得对照组和各暴露组的卵巢和早期胚胎,运用RT-PCR和Western blotting检测内质网应激信号通路相关分子的m RNA和蛋白表达水平,以期明确DEHP和MEHP暴露的雌性小鼠生殖毒性的作用机制。方法第一部分:通过同济医院实验动物中心购买两种周龄的ICR雌性小鼠,分别为4-5周龄和10周龄雌鼠,以及4-5周龄和12周龄ICR雄鼠。其中,4-5周龄雌鼠用于构建DEHP在体暴露模型,10周龄雌鼠用于IVF技术获得早期胚胎,进行MEHP体外暴露。第一,构建DEHP在体暴露模型。于鼠来宝实验动物技术公司定制含不同暴露剂量的DEHP小鼠饲料,设定各组暴露剂量分别为0,0.05,5,500 mg/kg/d,通过饮食方式建立DEHP在体暴露雌鼠模型,雌雄小鼠均饲养于同一SPF级饲养室,保证其所处环境条件一致,暴露周期为5周。暴露周期结束后,采用统一的PMSG-HCG方案对DEHP各暴露组以及对照组的雌鼠进行超促排卵,于HCG注射后15-18h采用颈椎脱臼法处死各组雌鼠,收集其双侧输卵管,分组置于IVF受精液中,运用IVF技术,获得各组雌鼠的卵丘复合物和精子并使其获能,通过体外受精形成早期胚胎,按照DEHP暴露剂量将其分组并连续培养于G-1和G-2胚胎培养液滴中,于受精后24h、48h、72h、96h、120h镜下观察并记录各组胚胎发育情况,统计各组胚胎的受精率、4-细胞率、8-细胞率以及囊胚形成率。120h时,收集各组囊胚,运用TUNEL技术检测各组囊胚凋亡信号并进行比较,探究不同剂量DEHP暴露一定时间后,对囊胚凋亡的影响。第二,构建小鼠胚胎MEHP体外暴露模型。将性成熟期雌雄小鼠（分别为10周龄和12周龄）在SPF级动物中心进行为期一周的适应性饲养后,转移至本实验室。同样,运用PMSG-HCG方案对雌鼠进行超促排卵,运用IVF技术获得2-细胞期胚胎,将其随机分为4组并分别连续培养于含MEHP浓度分别为0,10-5,10-4,10-3M的G-1、G-2胚胎培养液滴中,暴露时间为96h,持续至囊胚期,在开始暴露后的24h、48h、72h、96h时于体式显微镜下观察并记录各组胚胎发育情况,计算各组胚胎4-细胞率、8-细胞率及囊胚形成率,比较不同浓度MEHP对小鼠早期胚胎发育形态的影响。最后,收集各组囊胚,运用TUNEL技术检测囊胚凋亡信号,探究不同浓度MEHP暴露一定时间后,对囊胚凋亡的影响。第二部分:通过第一部分实验,探究了不同剂量DEHP及MEHP对小鼠早期胚胎发育的形态学影响。在此基础上,我们通过同样剂量的DEHP在体暴露实验（0,0.05,5,500 mg/kg/d）和胚胎MEHP(0,10-5,10-4,10-3M)体外暴露实验,分别运用RT-PCR和western blotting技术进一步探究DEHP和MEHP暴露的雌性小鼠生殖毒性的分子机制。第一,DEHP在体暴露小鼠模型的构建同第一部分。暴露周期结束后,运用PMSG-HCG方案对各组雌鼠进行超促排卵,于HCG注射后15-18h采用颈椎脱臼法处死各组雌鼠,收集双侧输卵管及卵巢,其中,卵巢用于RT-PCR,检测经DEHP暴露后,各组小鼠卵巢组织中内质网应激信号通路相关分子指标的m RNA表达水平,比较不同剂量DEHP对小鼠卵巢组织中内质网应激信号通路的影响。同时,运用IVF技术,获得各组雌鼠的卵丘复合物和精子并使其获能,通过体外受精形成早期胚胎,按照DEHP暴露剂量将其分组并培养于G-1胚胎培养液滴中,于24h、48h、72h镜下观察并记录各组胚胎发育情况。收集各组8-细胞期胚胎,分别运用RT-PCR和western blotting检测各组胚胎中内质网应激信号通路分子指标的m RNA和蛋白表达水平,在转录和翻译水平比较不同剂量DEHP对小鼠早期胚胎中内质网应激信号通路的影响。第二,性成熟期雌鼠在动物中心进行为期1周的适应性饲养后,采用PMSG-HCG方案对雌鼠进行超促排卵,于HCG注射后15-18h采用颈椎脱臼法处死各组雌鼠,运用IVF技术获得早期胚胎,将2-细胞胚胎随机分组并分别培养于含不同浓度MEHP(0,10-5,10-4,10-3M)的G-1胚胎培养液滴中,暴露时间为48h,收集各组8-细胞胚胎,运用RT-PCR检测各组胚胎中内质网应激信号通路分子指标的m RNA表达水平,比较不同浓度MEHP对小鼠早期胚胎中内质网应激信号通路的影响。结果第一部分:第一,通过DEHP在体暴露实验,我们发现,DEHP高暴露（500 mg/kg/d）可显著降低胚胎受精率和囊胚形成率（P＜0.05）,DEHP中暴露（5 mg/kg/d）可在一定程度上降低胚胎受精率和囊胚形成率,但无统计学差异,而DEHP低暴露（0.05mg/kg/d）对小鼠早期胚胎的发育形态学无影响。此外,TUNEL结果显示,DEHP中、高暴露组（5,500 mg/kg/d）的囊胚中均出现凋亡信号,且后者的凋亡信号明显强于前者,而DEHP低暴露组（0.05 mg/kg/d）的囊胚中未显示凋亡信号。第二,通过MEHP体外暴露实验,我们发现,MEHP高暴露(10-3M)可阻滞小鼠早期胚胎发育,显著降低4-细胞胚胎率、8-细胞胚胎率及囊胚形成率,而MEHP低、中暴露组(10-5M,10-4M)中的胚胎发育有延迟趋势,但无显著性差异。此外,TUNEL结果显示,MEHP高暴露(10-3M)组的囊胚中表现出明显的凋亡信号,而MEHP中、低(10-4M,10-5M)暴露组中的囊胚均未出现凋亡信号。第二部分:第一,通过DEHP在体暴露实验,我们发现,DEHP低、中、高暴露（0.05,5,500 mg/kg/d）均可诱导小鼠卵巢组织中内质网应激的发生,表现为Bi P,XBP-1S以及CHOP m RNA表达水平的显著性升高,均呈剂量依赖性。另外,我们发现,DEHP低、中、高暴露（0.05,5,500 mg/kg/d）均可诱导小鼠早期胚胎中内质网应激的发生,表现为与对照组相比,其Bi P m RNA的表达水平逐渐升高,其中,中、高暴露组中具有显著性差异。同卵巢组织,胚胎中CHOP m RNA的表达水平亦呈现随DEHP暴露剂量的增大而逐渐升高的趋势,呈剂量依赖性,而XBP-1及ATF6信号通路均未发生明显变化。胚胎western blotting结果显示,IRE1信号通路中未产生显著性应答,表现为与对照组相比,IRE1和XBP-1的蛋白表达量均无显著性差异。而PERK信号通路则显示出了主导地位,磷酸化PERK（p-PERK）,p-PERK/PERK,e IF2α,ATF4以及CHOP的蛋白表达量均呈剂量依赖性增加,且均具有统计学差异,这与胚胎RT-PCR结果中CHOP m RNA的表达量呈DEHP剂量依赖性增加的结果是一致的。第二,通过对小鼠早期胚胎进行MEHP体外暴露实验,我们发现,MEHP高暴露(10-3M)可诱导早期胚胎中内质网应激的发生,表现为Bi P m RNA表达水平的显著性升高,而下游信号通路中则以CHOP发生应答为主,表现为MEHP高暴露(10-3M)的胚胎中CHOP m RNA的表达量显著性增加,而XBP-1及ATF6 m RNA的表达水平均未发生显著性改变。提示,环境水平的低、中浓度MEHP暴露不会对早期胚胎发育产生内质网应激相关的分子水平的影响,只有在高暴露时,方可对胚胎产生形态学和分子水平的负面影响。结论第一部分:第一,DEHP高暴露具有延迟早期胚胎发育、降低胚胎受精率及囊胚形成率的毒性,且DEHP中、高暴露均可导致囊胚凋亡的发生。第二,MEHP低、中暴露对早期胚胎发育的形态学具有一定的负面影响,但无统计学差异,而MEHP高暴露可显著阻滞早期胚胎发育,降低4-细胞胚胎率、8-细胞胚胎率以及囊胚形成率（P＜0.05）,并且诱导囊胚中出现凋亡信号。日常生活及职业中所接触到的DEHP及主要代谢物MEHP的暴露水平不具有显著的生殖毒性或影响辅助生殖技术的生殖结局相关指标,而对于特定的DEHP/MEHP环境高暴露职业人群,则需认识到环境暴露对其自身生殖能力的影响,可在能力范围内尽早完成生育计划,以期降低由职业环境暴露所带来的生育相关的负面影响。第二部分:第一,DEHP低、中、高暴露（0.05,5,500 mg/kg/d）均可导致小鼠卵巢组织中内质网应激的发生,且可能以XBP-1信号通路为主,CHOP m RNA亦表现出明显的变化趋势,有待于进行PERK-e IF2α-ATF4-CHOP信号通路的深入研究。第二,DEHP中、高暴露可诱导小鼠早期胚胎中内质网应激的发生,且RT-PCR及western blotting在m RNA和蛋白水平均提示DEHP暴露导致的胚胎内质网应激可能以PERK-e IF2α-ATF4-CHOP信号通路为主,在本研究所设定的DEHP暴露剂量和时间下,IRE1及ATF6信号通路未产生明显的应答。第三,MEHP高暴露可诱导小鼠早期胚胎中内质网应激的发生,在本研究设定的暴露时间和剂量下,以CHOP信号通路的显著性变化为主。由于CHOP为促凋亡的标志性分子,其表达水平的升高可反应组织或细胞中凋亡现象的存在,与DEHP和MEHP暴露导致囊胚凋亡信号的出现是一致的。