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农药中毒事件频现给人们的生存环境污染和日常生活带来较大隐患,因此选择性高、自然降解且对环境不产生严重污染的绿色农药是目前农药研发的方向之一。大量化学合成农药副作用,例如农药残留、抗药性等,远胜于对农作物病虫害的抑制,来源于天然产物的陆源植物抑菌剂供应相对不足,加之陆源植物间适应性以及陆源植物资源大都已被过量使用,继续寻找活性更强的新型农药具有一定的难度,远不及特殊生境的海洋资源对植物病原菌的抑制活性显著,且海洋真菌次生代谢产物在对抗农作物病害方面,具有很大的潜力,这是本课题研究的出发点:以青岛海域丰富的海洋资源进行海洋内生真菌的分离纯化和活性筛选,对“奇特”菌株进行次级代谢产物进行农用生物活性成分的研究。使用4种不同营养成分的培养基发酵,通过比较生产力、代谢产物丰富度以及生物活性对4株海洋内生真菌进行筛选,结果发现:在生产力(次级代谢产物量)方面,RICE培养基的生产力较大,MH1培养基次之,其他次级代谢量较小。在代谢产物丰富度(TLC薄板层析)筛选中,发现培养基成分和培养时间的不同,均会对真菌的次级代谢产物产生较大影响,CCH-3和03-A的RICE培养基、10-A的MH1培养基次级代谢产物均比较丰富。生物活性筛选主要包含对细菌抑制活性和真菌抑制活性两个方面:对4株细菌抑菌活性筛选发现CCH-3的GPYM培养基产生的次级代谢产物活性最强,对BS的最大抑菌圈28mm(阳性对照为24mm),对SA的最大抑菌圈25mm(阳性对照为23mm),RICE培养基次之,其他3株菌抑菌活性中等(抑菌圈在10?18mm);对4株农业病原真菌抑菌活性结果发现CCH-3菌株由于其生长迅速且茂盛,农业真菌几乎没有扩增,具有明显的抑制作用。因此粗枝软骨藻来源的内生真菌(CCH-3)由于其生长形态奇异、次级代谢丰富、活性显著,作为继续深入研究的对象。使用分子生物学手段对海洋内生真菌CCH-3进行菌种鉴定,然后使用RICE培养基进行规模发酵,获得浸膏后进行VLC梯度洗脱,然后对不同极性粗组分进行农用抑菌活性跟踪,以Fr.5-Fr.12组分活性较好,其中以Fr.9组分对枯草芽孢杆菌(BS)的抑菌圈最大为21mm;对金黄色葡萄球菌(SA)抑制效果较好,抑菌圈为28mm;为了探究同源真菌CCH-1对其代谢产物的干扰以及影响,同时对CCH-3与CCH-1进行混合发酵;对抑菌活性较高的组分利用各种柱色谱(硅胶、凝胶、反相、制备板等)进行分离纯化,获得20余个单体化合物,通过现代波谱技术进行结构鉴定,4个化合物已获得结构鉴定。单体化合物AS-7对BS(抑菌圈为45mm,阳性对照是32mm)、SA(抑菌圈为47mm,阳性对照是33mm)、BT(抑菌圈为40mm,阳性对照是35mm)、EC(抑菌圈为40mm,阳性对照是33mm)、PA(抑菌圈为38mm,阳性对照是35mm)、XC(抑菌圈为42mm,阳性对照是32mm)的抑制效果都很好,抑菌圈均比氯霉素(阳性对照)更高,这说明单体化合物AS-7具有有较强的抑菌活性,值得进一步研究。本文从海洋内生真菌的分离纯化、优化培养入手,结合次级代谢产物的活性跟踪分离与结构鉴定,对CCH-3和CCH-1这2株内生真菌进行了系统研究,为海洋微生物农用资源的开发利用提供了一定的科学理论依据,也为新型农药研发提供必要且充分的基础保障。