A型流感病毒是引起人和动物流感流行的主要病原,H1和H3亚型流感病毒是A型流感病毒中感染宿主范围最广、流行面积最大和危害最为严重的两种病毒。实时荧光RT-PCR是A型流感病毒检测和亚型鉴定的一种主要技术,相继被世界卫生组织(WHO)推荐用于2009年甲型H1N1流感和2013年人感染H7N9禽流感病毒的检测。在我国,实时荧光RT-PCR也被应用于H5、H7、H9等亚型以及A型流感病毒通用检测中,并制定了相应的国家标准。本研究立足于我国尚缺乏针对H1和H3亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法的国家标准,开展了相关研究。同时,采用噬菌体装甲RNA技术,研制了流感病毒的新型核酸标准物质,为流感病毒核酸检测技术的质量控制奠定了物质基础。1.H1和H3亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法的建立在对A型流感病毒属病毒株序列比对的基础上,分别针对H1和H3亚型HA基因设计引物和LNA或MGB修饰的TaqMan短探针。在对引物、探针进行筛选和反应条件优化的基础上,分别建立了H1和H3亚型流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法。特异性试验表明,H1亚型流感病毒实时荧光RT-PCR可有效用于不同宿主来源和基因型毒株的检测,包括H1亚型人季节性流感病毒、古典H1N1猪流感病毒、类禽H1N1猪流感病毒和甲型H1N1流感病毒(2009)；H3亚型流感病毒实时荧光RT-PCR可有效用于不同宿主来源毒株的检测,包括H3N8马流感病毒、H3亚型禽流感病毒和猪流感病毒；且两种方法与其他亚型流感病毒和动物病毒均无交叉反应。灵敏性试验结果表明,H1和H3亚型流感病毒实时荧光RT-PCR对体外转录cRNA标准品检测极限分别为46和69拷贝/反应；重复性试验中,2种方法对含不同病毒核酸拷贝数样品重复检测3次,其Ct值的变异系数均小于5%。将2种方法应用于612份临床送检组织和拭子样品的检测,并与国家标准规定的普通RT-PCR进行比对,结果符合率均在95%以上,且本研究建立的方法比普通RT-PCR方法灵敏度高10倍和100倍。2.H1和H3亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法国家标准的起草和验证在2种实时荧光RT-PCR技术建立的基础上,申请获得了国家标准立项,完成操作过程的标准化研究,起草了《动物流感检测H1亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法》和《动物流感检测H3亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法》2项国家标准草案,明确规定了样品采集与前处理程序、样品核酸提取程序、荧光RT-PCR反应体系配制与加样程序、反应参数设置、结果判定原则、引物序列和探针序列等技术内容。2项标准草案在国内13家实验室对合计1519份临床样品验证的基础上,征求13家科研单位的意见形成送审稿。3.内含A型流感病毒M基因装甲RNA病毒样颗粒的构建和表达为构建流感病毒新型装甲RNA核酸质控品,将MS2噬菌体成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点以及流感病毒M基因克隆于表达载体pET32a中,经原核表达后,利用Cellufine sulfate层析柱纯化,经RT-PCR和实时荧光RT-PCR鉴定后研制了包装有流感病毒M基因的装甲RNA(Armored-M, AR-M)病毒样颗粒。稳定性研究表明,AR-M可耐受RNase的降解,且在-20℃和4℃至少可保存3个月以上。AR-M用作流感病毒核酸检测质控样品,具有稳定、无生物传染性、可真实模拟病毒粒子结构、耐RNase等特性,将其用作动物A型流感病毒核酸检测质控品可实现对检测全过程的质量控制。4.A型流感病毒核酸检测装甲RNA标准物质的研制将包装有流感病毒M基因RNA的病毒样颗粒,经A型流感病毒通用荧光RT-PCR定值后,制备了流感病毒核酸检测的标准物质。均匀性试验表明病毒样颗粒分布均匀,随机抽取的10管标准物质变异系数小于5%；稳定性试验证实装甲RNA标准物质非常稳定,在室温、2-8℃、-20℃分别可保存14天、3个月和6个月以上；经协作标定及不确定度分析,表明该标准物质的不确定度为0.34×106Copies/μL,含量定值为(3.54±0.34)x106Copies/μL,可实现待检样品的定量分析。流感病毒装甲RNA标准物质的推广应用,将为流感病毒核酸检测工作提供统一的、具有可比性的标准物质。综上所述,本研究建立了H1和H3亚型流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法,进而形成了相应的国家标准送审稿。同时,利用噬菌体病毒包装技术,构建了内含流感病毒核酸的装甲RNA标准物质。本研究制定的国家标准和研制的标准物质,将为流感病毒核酸检测技术的规范化使用提供重要的指导和保障。