论文部分内容阅读
第一部分血浆循环miRNA分析用于结直肠癌诊断的研究研究目的微小RNA (miRNA)是一类潜力巨大的肿瘤诊断标志物,但血循环miRNA在肿瘤诊断中的价值尚不清楚,本研究初步评估了血浆循环miRNA分析在结直肠癌(CRC)分子诊断中的价值,为寻找新的CRC无创性早期诊断方法提供新的思路。研究方法以14例CRC和10例正常对照者血浆总RNA为材料,采用Agilent miRNA表达谱芯片进行]niRNA表达谱分析,筛选在CRC患者血浆中上调的miRNA分子。用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术在新的样本组中进行进一步筛选和验证。采用ROC曲线分析血浆miRNA对CRC及进展期腺瘤的诊断价值；并选择20例CRC患者,分别收集手术前后的血浆标本,分析手术前后血浆差异表达miRNA的变化。研究结果血浆miRNA表达谱分析结果显示,在CRC血浆中上调的靶点有26个,下调的靶点29个。运用qRT-PCR技术(以miR-16为内参照)对32个候选靶点进行了验证,发现与正常对照组相比,CRC组及进展期腺瘤组血浆miR-29a和miR-92a水平均显著上调(P<0.001)。ROC曲线分析显示,血浆miR-29a和miR-92a诊断CRC的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.844和0.838,诊断进展期腺瘤的AUC分别为0.769和0.749。联合这两个靶点诊断CRC的AUC为0.883,敏感度和特异度分别为83.0%和84.7%,诊断进展期腺瘤的AUC为0.773,敏感度和特异度分别为73.0%和79.7%。此外,还发现手术后CRC患者血浆miR-29a和miR-92a含量均显著下降(P<0.05)。结论血浆miR-29a和miR-92a是潜在的CRC诊断分子标志物；血浆miRNA分析有可能发展成为一种新的非侵入性CRC早期诊断方法。第二部分IniR-95促进结直肠癌生长的研究研究目的研究miR-95对CRC细胞恶性表型的影响；并分析miR-95和CRC患者预后及肿瘤临床病理表型的关系,评估miR-95表达在CRC诊断、预后判断中的应用价值。研究方法采用Agilent miRNA表达谱芯片分析10对CRC组织(与癌旁正常组织比较)的miRNA表达谱。选择在CRC中上调的miR-95进行分子机制研究,利用慢病毒载体构建了miR-95的稳定细胞株,运用细胞培养、生长曲线分析、克隆形成实验、细胞转染、裸鼠成瘤等技术分析miR-95对CRC肿瘤生长的影响。同时使用qRT-PCR技术检测临床CRC标本中miR-95的表达,分析miR-95和CRC患者预后及肿瘤临床病理表型的关系。研究结果miRNA表达谱分析结果显示,CRC组织的miRNA表达谱式与对应正常粘膜组织相比存在显著差异,共筛选出49个差异表达基因,其中miR-95等26个靶点在CRC中显著上调。细胞增殖实验、克隆形成实验和裸鼠成瘤等实验均表明miR-95高表达可显著促进CRC细胞(HCT-116和LoVo)的生长,抑制其凋亡。而利用siRNA抑制miR-95表达后,HCT-8细胞的生长速率显著下调。运用qRT-PCR技术进一步分析了87例CRC组织中miR-95的表达,发现miR-95确实在肿瘤组织中显著上调(P<0.0001),但与肿瘤分期、分化、大小及总生存均无显著相关性。结论与正常结直肠组织相比,CRC组织的miRNA表达谱存在显著差异；miR-95能够促进CRC的生长,是潜在的CRC癌基因。第三部分miR-95靶基因的筛选及鉴定研究目的筛选并鉴定miR-95的靶基因,并探讨miR-95如何通过其靶基因参与CRC的发生发展。研究方法采用基因芯片技术分析miR-95稳定细胞株的表达谱与对照细胞的差异,同时运用miRNA靶基因预测软件TargetScan和miRanda对miR-95的靶基因进行生物信息学预测。根据芯片分析及软件预测筛选出miR-95的候选靶基因,克隆其3’-UTR,运用荧光素酶试验初步分析miR-95对这些基因的表达是否具有调控作用,对miR-95的潜在靶基因做进一步筛选。最后,运用qRT-PCR和Western blot技术验证候选靶基因在CRC细胞中的表达情况,用IHC技术检测靶基因在临床CRC标本中的表达情况。研究结果根据软件预测及基因芯片预测,筛选出9个候选靶基因进行验证。荧光素酶试验显示,SNX1、PTPN3和UBE4B基因的3’-UTR重组报告质粒的荧光素酶活性显著下调。Western blot分析进一步证实SNX1、PTPN3和UBE4B蛋白表达水平在miR-95稳定株中也显著下调。SNX1表达在77.8%(115/146)的CRC肿瘤组织中显著下调,且与miR-95的表达呈显著负相关。研究结论SNX1、PTPN3和UBE4B是miR-95的靶基因,miR-95可能通过抑制其表达参与CRC的发生发展。