一、研究目的眼部新生血管性疾病是多种致病因素所致的眼部并发症,是损害视力的主要因素之一,包括由于烧伤或移植而引起的角膜血管新生、各种原因引起的脉络膜血管新生及糖尿病引起的视网膜病变。作为一种血浆纤溶酶原的降解片段,血管抑素(angiostantin, As)以其强大的抗血管生成作用受到了人们的极大关注,自1994年O’Reilly等在荷兰小鼠血清及尿中发现至今的近20年中,国内外的研究者对其分子结构、抗血管生成的分子机制及提取方法进行了深入而广泛的探讨,并取得了可喜的成果。多年来,伴随着血管抑素的制备方法日臻完善,国内外许多学者已应用血管抑素对角膜、脉络膜、视网膜等眼部新生血管性疾病的防治工作做了大量的基础和临床研究,取得了显著的效果。而目前国内外血管抑素的相关研究仍停留在动物实验阶段,为了推动血管抑素更早更快的进入临床应用,如能对血管抑素滴眼液的制备方法加以优化,明确其处方,势必将极大推动血管抑素在临床的运用。因此,以《中国药典》2010年最新版相关内容为依据,在借鉴前人相关成功经验的基础上,本研究拟对血管抑素滴眼液的制备工艺进行完善,选择合适的处方制备重组人Kringle1-3血管抑素滴眼剂,对血管抑素滴眼液的外观、理化性质进行考察,运用紫外光谱法与Draize法分别对重组人Kringle1-3血管抑素滴眼剂的稳定性与刺激性进行研究。高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)测定血管抑素滴眼液在玻璃体中的浓度及分布,拟阐明血管抑素滴眼液的药代动力学。通过其在眼内药代动力学指标的检测,确定血管抑素的处方,旨在探索一种可用于临床治疗新生血管性疾病的血管抑素滴眼剂,以期规模化生产,使其适用于临床工作的需要,造福人类。二、研究方法与过程1、血管抑素滴眼剂的制备：配制含0.1%制备量的玻璃酸钠(滴眼液级)的磷酸盐缓冲溶液适量,称取0.01%制备量的苯扎氯铵,溶解于适当体积的磷酸盐缓冲液中,加入玻璃酸钠溶液,后向其中加入质量分数为0.1%的EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠盐),充分混匀,补加注射用水至制备量,即得血管抑素滴眼剂赋形剂溶液。将血管抑素滴眼剂赋形剂溶液于超净工作台中用0.22gm微孔滤膜除菌过滤得无菌血管抑素滴眼剂赋形剂溶液,量取适当体积无菌赋形剂溶液溶解适量重组人Kringle1-3血管抑素原料药,涡旋震荡至澄清透明,配制质量分数为0.01%(即质量浓度为100μg/ml)血管抑素滴眼剂若干,封装,即得重组人Kringle1-3血管抑素滴眼剂。2、血管抑素滴眼液质量控制：1)性状：采用留样观察法,观察血管抑素滴眼液的颜色、澄明度,鉴定是否存在异物。(按照《中国药典》2010版附录Ⅸ关于澄明度及可见异物的检查法进行测定)：2)血管抑素滴眼液pH的检测：使其pH符合《中国药典》2010年版有关滴眼液的规定。3)血管抑素滴眼液含量的测定：紫外吸收光谱法测定血管抑素滴眼液中血管抑素的含量；4)血管抑素滴眼液的刺激性检验：采用新西兰大白兔作为实验模型,运用Draize试验进行评价；5)血管抑素滴眼液的稳定性检验：因为常温下血管抑素理化性质不稳定,所以将血管抑素滴眼剂样品分别置于4℃±1℃及-20℃±2℃条件下保存,观察样品放置1月、3月及5月的外观、澄明度及可见异物(沉淀),分别测定放置1、3、5月时样品于280nm处的吸光度值,计算各时间点吸光度均值,评估重组人Kringle1-3血管抑素滴眼剂样品第1、3、5月相对于0个月的主药含量下降值,考察滴眼剂的稳定性。3、血管抑素滴眼液在兔眼内组织的分布：健康、无眼疾新西兰大白兔10只,随机分成5组,每组2只4眼,血管抑素滴眼液滴眼给药后选取0.5、1、2、5、8h5个取材点,各取材点取2只新西兰大白兔共4眼角膜、房水及玻璃体组织,高效液相色谱法测定给药0.5、1、2、5、8h后血管抑素滴眼液在角膜、房水及玻璃体中的浓度计分布(重复此实验中的HPLC实验2次),绘制标准曲线并考察精密度及回收率。4、血管抑素滴眼液眼内药代动力学的检测：将兔眼角膜、房水及玻璃体组织中的药物浓度经实用药物动力学程序(3p97)进行拟合,拟合出符合药动学房室模型,并计算相关药动学参数。三、结果1、性状测定结果：本实验制备的血管抑素滴眼液为无色澄清透明液体,按照《中国药典》2010版附录Ⅸ关于澄明度及可见异物的检查法进行测定,经检查血管抑素滴眼剂符合此标准。血管抑素滴眼液pH值为7.35,符合人眼对滴眼剂酸碱度的要求,经用数字贝克曼温度计测定重组人Kringle1-3血管抑素滴眼剂渗透压,结果显示其与泪液等渗。本制备工艺中0.1%玻璃酸钠的加入使重组人Kringle1-3血管抑素滴眼剂的黏度维持在合适水平(4.0-5.0cPa·s),延长了滴眼剂眼内滞留时间,促进了滴眼剂在眼内的分布。2、稳定性结果：(1)本实验制得的重组人Kringle1-3血管抑素滴眼剂不同温度条件下存放5个月时,其外观及澄明度不发生变化,无沉淀产生,理化性质稳定。(2)在含量考察方面,与0月(对照)吸光度相比,重组人Kringle1-3血管抑素滴眼剂4℃条件下保存5月的吸光度值与0月(对照)相比降低明显,具有统计学差异(P<0.05,表2),而-20℃条件下的各时间点吸光度则无显著性差异(P>0.05)(表2)；-20℃条件下各时间点吸光度均高于4℃条件下对应时间点的吸光度,且-20℃条件下1月、3月、5月含量降低值均低于4℃条件下对应时间点的含量降低值,表明重组人Kringle1-3血管抑素滴眼剂在低温条件下保存稳定性较好,且-20℃低温条件下保存其稳定性明显优于4℃条件。3、刺激性结果：在药物安全性评价中,Draize试验是评价眼刺激性的主要方法,结果发现血管抑素滴眼剂给药组与赋形剂组各时间点的Draize评分均<3分,表明血管抑素滴眼剂对兔眼几无刺激性。各组在给药期间兔眼主要表现与给药前基本相同,即结膜轻度充血,偶有少量分泌物等。4、HPLC条件测定：原药通过与辅料溶剂色谱图对照发现：3.3min与3.6min左右均有峰出,而原药在5.625min左右有另一峰出现,而溶剂色谱图在对应的时间点未有峰出现,说明血管抑素原药的出峰时间大致为5.6min左右。5、空白玻璃体HPLC图谱：保留时间为5.844min的时间点有峰出现,对比100μg/ml的血管抑素原药的色谱图中血管抑素于5.6min左右出峰,相同的5-20%乙腈(含0.1%TFA)—95-80%水(含0.1%TFA)—35min梯度洗脱条件及相同的210nm检测波长下,在近似相等的保留时间点均有峰出,证明眼空白玻璃体组织中有内源性的血管抑素存在。6、给药后各时间点玻璃体HPLC图谱测定：通过收集滴眼给药后0.5h、1.0h、2.0h、5.0h及8.0h的玻璃体样品进行HPLC发现：各时间点血管抑素原药的出峰峰高及峰面积均高于空白玻璃体样品,给药0.5h后血管抑素出峰峰高及峰面积分别增加21.76%与20.15%,到给药1h血管抑素出峰峰高及峰面积增加比例最多,分别达到153.59%与511.15%,以后各点原药出峰的峰高及峰面积增加值逐渐减小,到8.0h时间点降为46.97%与208.48%。四、结论1、制备重组人Kringle1-3血管抑素滴眼剂性状：本实验制备的血管抑素滴眼液为无色澄清透明液体,经澄明度及可见异物的检查方法检测后符合《中国药典》2010版附录Ⅸ的对其的要求,血管抑素滴眼液pH值为7.35,符合人眼对滴眼剂酸碱度的要求,且其与泪液等渗,本制备工艺中0.1%玻璃酸钠的加入使重组人Kringle1-3血管抑素滴眼剂的黏度维持在合适水平(4.0-5.0cPa·s),延长了滴眼剂眼内滞留时间,促进了滴眼剂在眼内的分布。可知本实验制备的血管抑素符合《中国药典》2010对滴眼剂的要求。2、重组人Kringlel-3血管抑素滴眼剂的稳定性考察中,通过在制备处方中加入0.1%的EDTA-Na2做为螯合稳定剂,血管抑素滴眼剂在-20℃条件下保存5月的吸光度值与0月对照组相比降低不多,含量下降值仅为(13.31±3.93)%,较有效地克服了血管抑素做为糖蛋白本身稳定性低的缺点,提高了制剂的稳定性。3、重组人Kringle1-3血管抑素滴眼剂的刺激性考察中,各组在给药期间兔眼主要表现与给药前基本相同,即结膜轻度充血,偶有少量分泌物等,给药后各时间点的情况根据Draize评分分值均小于3分,与赋形剂及生理盐水组分值差别不大,表明本制备方法所得血管抑素滴眼剂对兔眼无刺激性。4、血管抑素(angiostatin, AS)属血浆纤溶酶原的内部片段,已经证实的血管抑素有Kringlel-3、Kringle4、Kringle1-4、Kringle1-4.5与Kringle5等5种。本实验通过改变流动相配比、洗脱条件及检测波长等方法,摸索出在210nm,5-20%乙腈,95-80%水,35min梯度洗脱条件下可较好地分离重组人Kringle1-3血管抑素,得到较好的峰形,在此条件下重组人Kringle1-3血管抑素的出峰时间约为5.6min左右。取空白玻璃体样品按摸索出的条件进行HPLC发现：在近似相等的保留时间有峰出,且峰形单一,表明在眼部组织中有内源性的Kringle1-3血管抑素存在。5、药物滴眼后,在不同时间点取材进行HPLC,实验证实各时间点的血管抑素原药峰高及峰面积均高于空白玻璃体组织,且原药在滴眼1h后在玻璃体的分布值达到最大,此后随着时间的推移Kringle1-3血管抑素在眼内的分布开始逐渐降低,到8h时降低幅度最大,峰高仅比空白组织增加46.97%,峰面积增加208.48%。说明滴入眼内的血管抑素在眼部1.0h左右分布达到高峰,此后随时间的推移分布逐渐开始减少。