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毛榛(Corylusmandshurica Maxim.)榛仁粕是生产榛仁油的副产物,更是一种优质的植物蛋白源。目前其利用率较低,常被作为饲料或肥料低价出售,榛仁粕的开发利用可以大大提高毛榛的附加值。本文以脱脂的毛榛仁粕为原料,采用混菌固态发酵法制备降血压肽,筛选最佳发酵菌种组合并优化其发酵工艺。将制备的降血压肽进行分离纯化,并对其降血压效果最佳的组分进行氨基酸序列鉴定。最后通过细胞试验验证了毛榛仁粕降血压肽的功能。1、通过对毛榛仁粕基本成分的测定,毛榛仁粕中蛋白质含量高达51.19 g/100g,其还原糖含量较高,可以满足微生物发酵所需的碳源和氮源,是较好的生物活性肽制备原料,而且可以作为固态发酵的原料。采用固态发酵的方法,以蛋白酶活力、水解度、粗多肽得率为指标筛选蛋白酶产量较高的菌株。结果表明枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉更适合固态发酵榛仁粕;将三种菌株等比接种量两两混合,在一定的条件下对毛榛仁粕进行发酵,发现采用枯草芽孢杆菌和米曲霉组合菌株发酵产物的ACE抑制率、水解度和粗多肽得率较高,分别为22.11%、21.74%和19.66%,确定枯草芽孢杆菌和米曲霉组合菌株为混菌固态发酵的最佳菌种组合。2、在确定混菌固态发酵的最佳菌种组合的基础上,通过单因素试验和正交试验对固态发酵毛榛仁粕制备降血压肽的发酵工艺进行优化,优化后的最佳工艺条件为枯草芽孢杆菌和米曲霉菌种比例2:3,接种量15%,水分含量60%,发酵温度40℃,发酵时间72 h。在此条件下发酵样品的ACE抑制率、水解度及粗多肽得率分别为45.24%,30.13%和 25.53%,其中 ACE 抑制率提高了 104.60%。3、将微生物法制备的毛榛仁降血压肽进行分离纯化,通过超滤法,得到发酵产物的多肽提取液3个组分,其中组分1(<3 KD)的ACE抑制活性最高;进一步采用葡聚糖凝胶(SephadexG-25)对组分1中的多肽进行二次纯化,葡聚糖凝胶色谱的最佳分离工艺.:去离子水作为洗脱剂、样品浓度为50mg/mL(上样体积1.00mL)、洗脱流速为0.4mL/min的条件下,毛榛仁ACE抑制肽分成3个不同组分。其中G-2组分的ACE抑制抑制率最高达75.46±0.72%,较超滤后的组分1的ACE抑制率提高了 20.06%。4、将G-2组分通过纳升级液相色谱-质谱(Nano-UPLC-MS)检测,鉴定其氨基酸序列,通过与BIOPEP数据库对比得到4个多肽,Ala-Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Val-Leu(ASFLLRNVL)、Ile-Asp-Tyr-Pro-Asn-Val-Leu-Arg(IDYPNVLR)、Ala-Pro-Leu-Lys-Ala-Phe-Gly-Arg-Thr(APLKAFGRT)、Lys-Lys-Lys-Pro-Glu(KKKPE)分子量分别为1031.6128Da、988.5342Da、959.5552Da、628.3907Da。未匹配的多肽通过DeNovo蛋白质测序分析法检测发现G-2组分中还有61条具有6～14个氨基酸的短链肽,其分子量均小于1.5 KD,经过氨基酸组成分析发现其序列中具有大量的疏水性氨基酸、碱性氨基酸和芳香族氨基酸,占总氨基酸数的59.97%。由此证明毛榛仁降血压肽是具有ACE抑制肽特征的多肽。5、利用纯化后G-2组分进行细胞实验,对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行培养观察,并测定培养液中NO、ET的释放量,结果显示添加毛榛仁降血压肽能促进人脐静脉内皮细胞释放NO,而降低ET的释放。证明毛榛仁降血压肽降血压肽在一定浓度范围具有降血压药物卡托普利类似的降血压作用。