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副溶血弧菌由于其传播速度快,致死率高,危害性大,已经在世界范围内对斜带石斑鱼养殖产业造成了巨大的经济损失。Toll样受体(TLRs)作为机体天然免疫过程中的重要受体,能够参与识别多种病原相关分子模式(PAMPs),之后通过MyD88依赖型信号通路或TRIF信号通路,激活免疫细胞产生细胞因子以抵御病原体的侵袭。小鼠TLR13能够识别细菌23S rRNA上一段保守序列并诱导机体的免疫应答,通过MyD88依赖的信号通活化NF-κB进而诱导白介素(IL)和肿瘤坏死因子(TNF)等炎性细胞因子的产生。鱼类TLR13的免疫功能研究尚处在起步阶段,本研究希望挖掘斜带石斑鱼TLR13在副溶血弧菌识别中所承担的角色,分析TLR13识别副溶血弧菌后其信号通路下游细胞因子的表达水平变化,并尝试通过构建副溶血弧菌TLR13识别位点突变株深入分析斜带石斑鱼对副溶血弧菌的识别和清除机理。本研究主要结果和内容如下:1.分离副溶血弧菌的不同组分——RNA、DNA和鞭毛蛋白(flagellin),并加上两种细菌组分——LPS和PGN,离体刺激斜带石斑鱼脾脏细胞系(GS细胞系),采用Real-timePCR技术检测TLR13mRNA表达模式。结果显示,受副溶血弧菌RNA和flagellin刺激后,GS细胞中的TLR13 mRNA水平都发生一定程度的上调,而在DNA的刺激下TLR13的表达量与对照组相比几乎没有变化。其中,在副溶血弧菌RNA刺激下,TLR13基因表达水平上调幅度最大,并且在刺激6 h达到表达高峰;而经过RNase A处理后的副溶血弧菌RNA并不能刺激TLR13表达。这表明斜带石斑鱼TLR13很可能参与机体对副溶血弧菌RNA的免疫应答。2.利用靶向抑制斜带石斑鱼TLR13的siRNA转染GS细胞,降低TLR13基因在GS细胞中的表达,采用Real-time PCR技术检测在VP-RNA刺激后TLR13信号通路下游细胞因子基因的表达模式。结果显示,转染TLR13-siRNA后,GS细胞中TLR13的基因表达量与对照组相比降低了 50%。在VP-RNA刺激下,对照组中IL-1β、IL-12、IL-6和TNF-α等细胞因子都被强烈诱导表达;而当TLR13-siRNA转染至GS细胞后,四种细胞因子的mRNA水平均呈现不同程度的下降。这一结果揭示斜带石斑鱼TLR13参与副溶血弧菌RNA识别,并可以诱导炎性细胞因子的产生以抵御细菌的侵害。3.通过合成副溶血弧菌中与小鼠TLR13配体同源的序列VP13(5’-ACGGAAAGACCCC-3’ ),采用 Real-time PCR 技术检测在 VP13 刺激后,GS细胞中TLR13基因的表达模式。结果显示,在VP13刺激下,GS细胞中TLR13 mRNA表达量显著提升,并在刺激6h达到了最高的表达量,表明斜带石斑鱼TLR13也可以响应副溶血弧菌中与小鼠TLR13配体同源的序列的刺激。4.用VP13刺激转染了 TLR13-siRNA的GS细胞,检测TLR13下游细胞因子基因的表达模式。Real-timePCR结果显示,四种细胞因子的表达量均在VP13刺激下发生上调,并在TLR13被靶向沉默后呈现下降趋势。5.利用自杀质粒同源重组技术构建副溶血弧菌23S rRNA上TLR13识别位点缺失的突变菌株,成功扩增副溶血弧菌23S rRNA中“ACGGAAAGACCCC”序列缺失的上下游同源臂融合片段,并获得测序正确的重组载体,经过两轮重组后暂未获得目的突变菌株。