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【目的】
通过测定高龄妊娠人工流产孕妇及高龄妊娠不明原因复发性流产孕妇蜕膜组织中线粒体自噬（PINK1/Parkin途径）相关因子在mRNA及蛋白表达水平，探索线粒体自噬是否与了高龄妊娠不明原因复发性流产的发生，同时探讨其参与不明原因复发性流产的可能机制。
【方法与方法】
1.实验标本的采集及标准：
①正常高龄孕妇人流后的蜕膜②高龄妊娠稽留流产（与同一性伴侣，至少有过一次自然流产史的稽留流产）孕妇人流手术后的蜕膜组织。收取标本前，查询患者病例信息，对患有自身免疫性疾病、严重的宫内感染性疾病、染色体异常等自身疾病的孕妇不予收取。收取标本后，再次查询病例信息，排除本次稽留流产的胚胎为染色体异常的标本。
2.新鲜的蜕膜组织的处理：
①液氮中保存-提取蛋白
②保存于含有RNAlater的标本采集管中，-20℃冰箱过夜-提取RNA
③保存于含有多聚甲醛的标本管中-电镜下观察下线粒体
④新鲜标本冰冻切片-免疫荧光实验。
3.分组及入组标准
1）高龄妊娠不明原因复发性流产组(HA)
①单胎及双胎妊娠
②年龄≥35岁
③本次胎儿停育，行刮宫手术，且符合不明原因复发性流产的诊断标准(育龄期的妇女与同一个性伴侣,在妊娠28周前，发生连续的2次或3次及以上的自然流产,且病因不明）。
2）高龄妊娠人工流产组(HB）
①单胎及双胎妊娠
②年龄≥35岁
③本次为活胎，自愿刮宫人工流产手术
4.评估指标：
1）电镜下观察高龄妊娠不明原因复发性流产与人工流产蜕膜组织中线粒体的形态和结构改变。
2）免疫荧光技术观察LC3B在高龄孕妇子宫蜕膜、绒毛组织中的的表达
3）检测线粒体自噬相关因在高龄孕妇子宫蜕膜组织中的mRNA和蛋白表达情况：Q-PCR技术和Westernblot技术检测线粒体自噬相关因子LC3B、Parkin、NRF1、以及OPA1在mRNA和蛋白水平上的表达情况。
4）检测线粒体自噬调控炎症免疫通道，参与高龄妊娠不明原因复发性流产的相关机制：通过Q-PCR技术检测高龄孕妇蜕膜组织中NLRP3在mRNA水平上的表达情况。
5）检测线粒体调控氧化应激通道，参与高龄妊娠不明原因复发性流产的相关机制：通过Q-PCR技术检测高龄孕妇蜕膜组织中PINK1、Nrf2、Keap1在mRNA水平上的表达情况。
5.统计学分析:
采用SPSS19.0软件对检测所得的数据进行统计分析，计量资料以(x)±S表示，两组数值变量之间的比较，采用wilcoxon秩和检验。计数变量之间的比较采用卡方检验fisgers确切概率法，检验水准a=0.05,P＜0.05为差异有统计学意义。
【结果】
1.高龄妊娠不明原因复发性流产组与高龄妊娠人流组之间，在年龄、孕次、孕周、取样时BMI和吸烟的基本情况之间差异无统计意义（P＞0.05），而高龄妊娠不明原因复发流产组的产次明显低于高龄妊娠人工流产组，差异具有统计意义（P＜0.05）。
2.正常高龄妊娠状态下蜕膜线粒体形态正常，可见明显的线粒体脊的存在，细胞质中可见高尔基体和细胞核结构。而在高龄妊娠不明原因复发性流产孕妇的蜕膜细胞中，线粒体呈现固缩状态，颜色较深，基本分不清线粒体脊的存在，部分可见线粒体肿胀，在胞浆可见自噬溶酶体的存在。
3.免疫荧光检测发现，LC3B蛋白表达在细胞质中，与高龄妊娠人工流产孕妇相比较，高龄妊娠不明原因复发性流产孕妇蜕膜组织中线粒体自噬因子LC3B的表达明显较多。
4.与高龄妊娠人工流产孕妇相比较,高龄妊娠不明原因复发性流产孕妇蜕膜组织中自噬相关因子，Parkin、LC3B、NRF1、以及OPA1在mRNA和蛋白水平上的表达水平有明显升高的趋势,其中Parkin、LC3B、NRF1的蛋白表达水平差异有统计意义（P＜0.05）。
5.与高龄妊娠人工流产孕妇相比较,高龄妊娠不明原因复发性流产孕妇蜕膜组织中，炎症免疫通道因子NLRP3在mRNA表达水平有明显升高的趋势。
6.与高龄妊娠人工流产孕妇相比较,高龄妊娠不明原因复发性流产孕妇蜕膜组织中，氧化应激通道相关因子PINK1在mRNA水平上的表达水平有明显升高的趋势，而在Keap1、Nrf2在mRNA水平上的表达水平有明显降低的趋势。
【结论】
1.线粒体自噬参与了高龄妊娠不明原因复发性流产的的发生
2.线粒体自噬可能是通过调控炎症免疫通道和氧化应激通道共同参与了高龄妊娠不明原因复发性流产的发生。
通过测定高龄妊娠人工流产孕妇及高龄妊娠不明原因复发性流产孕妇蜕膜组织中线粒体自噬（PINK1/Parkin途径）相关因子在mRNA及蛋白表达水平，探索线粒体自噬是否与了高龄妊娠不明原因复发性流产的发生，同时探讨其参与不明原因复发性流产的可能机制。
【方法与方法】
1.实验标本的采集及标准：
①正常高龄孕妇人流后的蜕膜②高龄妊娠稽留流产（与同一性伴侣，至少有过一次自然流产史的稽留流产）孕妇人流手术后的蜕膜组织。收取标本前，查询患者病例信息，对患有自身免疫性疾病、严重的宫内感染性疾病、染色体异常等自身疾病的孕妇不予收取。收取标本后，再次查询病例信息，排除本次稽留流产的胚胎为染色体异常的标本。
2.新鲜的蜕膜组织的处理：
①液氮中保存-提取蛋白
②保存于含有RNAlater的标本采集管中，-20℃冰箱过夜-提取RNA
③保存于含有多聚甲醛的标本管中-电镜下观察下线粒体
④新鲜标本冰冻切片-免疫荧光实验。
3.分组及入组标准
1）高龄妊娠不明原因复发性流产组(HA)
①单胎及双胎妊娠
②年龄≥35岁
③本次胎儿停育，行刮宫手术，且符合不明原因复发性流产的诊断标准(育龄期的妇女与同一个性伴侣,在妊娠28周前，发生连续的2次或3次及以上的自然流产,且病因不明）。
2）高龄妊娠人工流产组(HB）
①单胎及双胎妊娠
②年龄≥35岁
③本次为活胎，自愿刮宫人工流产手术
4.评估指标：
1）电镜下观察高龄妊娠不明原因复发性流产与人工流产蜕膜组织中线粒体的形态和结构改变。
2）免疫荧光技术观察LC3B在高龄孕妇子宫蜕膜、绒毛组织中的的表达
3）检测线粒体自噬相关因在高龄孕妇子宫蜕膜组织中的mRNA和蛋白表达情况：Q-PCR技术和Westernblot技术检测线粒体自噬相关因子LC3B、Parkin、NRF1、以及OPA1在mRNA和蛋白水平上的表达情况。
4）检测线粒体自噬调控炎症免疫通道，参与高龄妊娠不明原因复发性流产的相关机制：通过Q-PCR技术检测高龄孕妇蜕膜组织中NLRP3在mRNA水平上的表达情况。
5）检测线粒体调控氧化应激通道，参与高龄妊娠不明原因复发性流产的相关机制：通过Q-PCR技术检测高龄孕妇蜕膜组织中PINK1、Nrf2、Keap1在mRNA水平上的表达情况。
5.统计学分析:
采用SPSS19.0软件对检测所得的数据进行统计分析，计量资料以(x)±S表示，两组数值变量之间的比较，采用wilcoxon秩和检验。计数变量之间的比较采用卡方检验fisgers确切概率法，检验水准a=0.05,P＜0.05为差异有统计学意义。
【结果】
1.高龄妊娠不明原因复发性流产组与高龄妊娠人流组之间，在年龄、孕次、孕周、取样时BMI和吸烟的基本情况之间差异无统计意义（P＞0.05），而高龄妊娠不明原因复发流产组的产次明显低于高龄妊娠人工流产组，差异具有统计意义（P＜0.05）。
2.正常高龄妊娠状态下蜕膜线粒体形态正常，可见明显的线粒体脊的存在，细胞质中可见高尔基体和细胞核结构。而在高龄妊娠不明原因复发性流产孕妇的蜕膜细胞中，线粒体呈现固缩状态，颜色较深，基本分不清线粒体脊的存在，部分可见线粒体肿胀，在胞浆可见自噬溶酶体的存在。
3.免疫荧光检测发现，LC3B蛋白表达在细胞质中，与高龄妊娠人工流产孕妇相比较，高龄妊娠不明原因复发性流产孕妇蜕膜组织中线粒体自噬因子LC3B的表达明显较多。
4.与高龄妊娠人工流产孕妇相比较,高龄妊娠不明原因复发性流产孕妇蜕膜组织中自噬相关因子，Parkin、LC3B、NRF1、以及OPA1在mRNA和蛋白水平上的表达水平有明显升高的趋势,其中Parkin、LC3B、NRF1的蛋白表达水平差异有统计意义（P＜0.05）。
5.与高龄妊娠人工流产孕妇相比较,高龄妊娠不明原因复发性流产孕妇蜕膜组织中，炎症免疫通道因子NLRP3在mRNA表达水平有明显升高的趋势。
6.与高龄妊娠人工流产孕妇相比较,高龄妊娠不明原因复发性流产孕妇蜕膜组织中，氧化应激通道相关因子PINK1在mRNA水平上的表达水平有明显升高的趋势，而在Keap1、Nrf2在mRNA水平上的表达水平有明显降低的趋势。
【结论】
1.线粒体自噬参与了高龄妊娠不明原因复发性流产的的发生
2.线粒体自噬可能是通过调控炎症免疫通道和氧化应激通道共同参与了高龄妊娠不明原因复发性流产的发生。