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糖胺聚糖（glycosaminoglycans,GAGs）是一种由已糖醛酸和已糖胺重复二糖单元组成的线性多糖,在生物医药和材料方面应用广泛。GAGs能与多种蛋白受体和趋化因子相互作用,在抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、免疫调节等多种生理过程中发挥着重要的作用。肝素（heparin,HP）作为GAGs一个重要成员,因其具有抗凝血活性而被广泛应用于临床治疗。然而,目前使用的HP类药物的原料全部是动物组织（如猪小肠黏膜）中提取的,这导致提取到的多糖结构不均一,且容易受到污染,这些缺点都限制了HP类药物的发展。在过去的十几年中,人们对开发非动物源性HP的生产方法越来越感兴趣,例如化学合成、化学酶法合成、代谢工程等合成策略。前期研究表明,Escherichia coli O10:K5（L）:H5（ATCC23506,简称 E.coli K5）的荚膜多糖heparosan与未经硫酸化、异构化的HP骨架结构相同。Heparosan作为细菌荚膜多糖,制备工艺简单,且不易受污染,为以HP的类似物用于生物合成非动物来源的不同硫酸化度的肝素提供了广阔前景,且作为一种天然多糖,heparosan本身也是一种优良的载药材料,具有很好的药用价值。然而,野生菌株E.coli K5合成heparosan的能力较低（～100 mg/L）。通过合成生物学手段改造天然菌株,或者将heparosan合成途径引入底盘细胞,从头构建高产肝素骨架多糖的工程菌株成为制备heparosan的有效途径。因此,heparosan合成途径、调控机制及高产菌株驯化等研究方向成为研究热点。此外,随着肝素寡糖体外酶法合成体系的发展,通过对heparosan合酶等肝素骨架合成相关酶分子定向进化,获得更高效的工具酶分子,也被科学界日益重视。Heparosan的代谢合成受到多方位的调控,这个途径的调节是通过许多基因转录水平的变化完成的,而相关基因的转录水平是由基因组上的启动子控制的。通过系统的分析,自E.coli K5发掘并初步分析响应heparosan的合成能力的启动子元件是本论文的研究内容。本论文的研究内容及取得的结果及结论如下:（1）基于E.coli K5菌株可以天然合成heparosan,通过基因编辑或蛋白重组技术体系,构建获得一系列heparosan合成能力不同的E.coli K5工程菌株。研究基于CRISPR/Cas9基因编辑系统技术建立了一套E.coli K5基因编辑技术。通过应用该技术,自野生型E.coli K5基因组中敲除heparosan合酶编码基因KfiA,获得heparosan合成能力完全缺失的工程菌株E.coli K5NK;自野生E.coli K5基因组中敲除heparosan裂解相关基因ElmA,获得heparosan合成能力变化的工程菌株E.coli K5NE;同时,构建了一个超表达KfiA的质粒并将其转化进E.coli K5,获得一株具有较强heparosan合成能力的E.coli K5菌株——E.coli K5OK。（2）完成了 heparosan合成能力具有明显差异的E.coli K5NK、E.coli K5NE和E.coli K5的转录组分析,确定Pgnt、Pgat与Pmp的启动转录水平与heparosan合成水平明显相关。根据转录组数据可信度及统计学差异分析,在heparosan合成能力完全缺失的E.coli K5NK中,相较于野生型E.coli K5有45个基因的转录水平有显著性上调,有226个基因的转录水平有显著性下调,结合转录水平变化及其基因所编码蛋白的功能分析,确定膜蛋白基因（编号为ECK57980）、葡萄糖醛酸转移酶基因（编号为ECK522940）、N-乙酰葡萄糖胺转移酶基因（编号为ECK522960）的转录水平与heparosan合成水平明显相关。克隆并确定了启动子Pgnt、Pgat与Pmp。利用生物信息学手段,自E.coli K5全基因组数据库中分别确定了上述3个蛋白编码基因的启动子信息,分别命名为Pgnt、Pgat 与 Pmp;利用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）作为报告基因,成功克隆并确定了 Pgnt、Pgat、Pmp的序列。（3）确定了启动子Pgnt、Pgat、Pmp可以响应E.coli K5中heparosan的合成能力。基于对上述启动子调控下GFP在E.coli K5NK、E.coli K5和E.coli K5OK中的表达情况分析,确定含有Pgnt、Pgat、Pmp启动子报告基因系统的菌株的萤光强度皆随着heparosan合成能力的增强而增强;其中,Pgat启动子的转录水平受到菌株的heparosan合成能力的调控最为明显。综上,在E.coli K5菌株中,我们成功的确定了启动子Pgat的转录水平与heparosan合成能力呈正相关。该研究发现不但对细菌荚膜多糖的合成调控机制研究具有理论价值,而且该启动子序列可以用于heparosan合成能力的生物传感器的构成元件,也可用于KfiA等GTs细胞内定向平台的构建,应用价值同样突出。