EB病毒(Epstein-BarrVirus，EBV)在人群中普遍易感，与人类传染性单核细胞增多症、Burkitts淋巴瘤、鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)等多种疾病相关。在体内，EB病毒只能感染人上皮细胞和B淋巴细胞；在体外，EB病毒能转化静止期B淋巴细胞使其永生化(immortalization)。目前关于EB病毒致病机制的研究结果相当一部分来自与病毒相关的人永生化B淋巴细胞。 静止期B细胞是终末分化细胞，在没有抗原刺激时不能进行有丝分裂。永生化B淋巴细胞也叫淋巴母细胞(lymphoblastoidcelllines，LCLs)，能持续不断的分裂增殖传代，可以有效保留B细胞的遗传信息，因此可以作为一种细胞模型用于多种宝贵疾病资料的保存以及回顾性研究。 LCL的永生化机制虽经多年研究，仍未解释清楚。已有研究资料揭示该永生化过程非常复杂，与EB病毒的潜伏膜蛋白(latentmembraneprotein，LMP)、病毒核抗原(nuclearantigen，NA)以及淋巴细胞癌基因、抑癌基因等多种分子有关。研究表明在LCL形成早期有一过性的stathmin蛋白表达水平增高，推测stathmin在B细胞永生化过程中发挥重要作用。 Stathmin1是普遍表达于真核细胞的一种微管调节蛋白，其表达水平在不同组织细胞中有较大差异。在更新较快、生长旺盛的组织，如骨髓和睾丸中表达水平较高，而在成人脑、脊髓等组织中的表达水平较低；另外，在部分肿瘤细胞如白血病细胞、淋巴瘤细胞、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、神经系统胶质瘤细胞中也有较高水平的stathmin1表达。 已证实Stathmin1可以直接和微管亚单位α/β二聚体相互作用形成stathmin1-α/β蛋白三聚体抑制微管蛋白的聚合；此外，stathmin1还可以促进微管塌陷。部分研究结果显示细胞内stathmin1的稳定表达对于细胞维持生长状态具有非常重要的意义，人为增加或者降低stathmin1表达水平可以明显阻断肿瘤细胞的增殖分裂。同样，stathmin1正常空间结构所依赖的氨基酸序列对于其发挥微管调节功能意义重大。149个氨基酸构成的单肽链结构，N末端、C末端靠近肽链中间部分都能对stathmin1-α/β蛋白三聚体的稳定起到促进作用，但是只有C末端通过增加GTP酶活性水解GTP降低微管稳定性，促进微管解聚。C末端7个氨基酸的缺失可以明显减弱stathmin1的微管解聚作用。 Stathmin1分子上有四个磷酸化位点，磷酸化水平决定了stathmin1的功能状态，当四个位点全部都被磷酸化以后stathmin1失活。在细胞有丝分裂过程中，stathmin1通过不断调节磷酸化/去磷酸化过程而影响微管的组装与解聚，从而影响纺锤体的形成与降解。在有丝分裂间期，stathmin1处于非磷酸化状态，参与微管组装/去组装的调节，维持细胞正常状态；有丝分裂早期，stathmin1被磷酸化，微管蛋白组装成微管，进而形成有丝分裂必须的纺锤体；有丝分裂后期，stathmin1去磷酸化，微管解聚，纺锤体消失，细胞退出有丝分裂。在细胞周期中stathmin1的磷酸化/去磷酸化水平需要多次改变以维持细胞的正常分裂。因此，stathmin1和细胞生长增殖密切相关，已经成为一个抗肿瘤的研究热点。有报道称stathmin1参与了EB病毒相关的B淋巴细胞的永生化过程。 世界上80％的鼻咽癌患者出现在我国广东省。95％的鼻咽癌患者临床组织分型为低分化鳞癌或者未分化癌，常规治疗方法首选放疗，必要时结合化疗，疗效较好，但副作用较明显。运用分子生物学方法针对鼻咽癌细胞低分化株凋亡的研究可能会为鼻咽癌生物治疗提供一定理论依据。 本课题用活病毒感染人静止期B淋巴细胞，建立了永生化B淋巴细胞系并对其生物学性状做了初步鉴定；着眼于stathmin1，利用分子生物学技术克隆其基因全序列到穿梭质粒中构建stathmin1野生型克隆载体，设计并构建其突变体，同时利用两步PCR法构建三个针对stathmin1的干扰载体。在以正常人黑色素细胞为代表的正常细胞株以及鼻咽癌低分化鳞癌CNE-2细胞株为代表的恶性肿瘤细胞中研究stathmin1对于细胞生长增殖的意义，探讨stathmin1与细胞凋亡的关系。 主要研究方法和结果如下： 1、培养B95-8细胞，收集悬液，过滤获得EBV活病毒，感染人外周血淋巴细胞使B细胞永生化获得成功。细胞可以不断传代培养，流式细胞仪检测细胞生长旺盛，未出现凋亡峰。对永生化细胞利用流式细胞仪分析LCL细胞表面的白细胞分化抗原，结果为CD19阳性，确定其细胞来源为B淋巴细胞。RT-PCR方法检测细胞内EBV潜伏膜蛋白1基因表达阳性证明永生化与EB病毒相关。对永生化细胞进行核型分析表明永生化早期的细胞核型正常，没有染色体的结构畸变。 2、两步PCR法扩增得到三段针对stathmin1mRNA的带有U6启动子的shRNA编码框SEC(shRNAexpressingcassette)。设计引物从穿梭质粒pAdTrack中克隆出带有CMV启动子的绿色荧光蛋白基因全序列(CMV-EGFP)，对pBluescriptIIKS(+)质粒进行荧光化改造，成功构建用于RNA干扰的载体pBlue-EGFP-U6-si1/2/3并经测序鉴定。 3、设计引物从人肺癌细胞A549中利用RT-PCR方法调取stathmin1基因全长，电穿孔转化法成功构建克隆载体pAdTrack-stathmin1。蛋白质在线数据库SWISS-PROT设计Stathmin1C末端突变体，在pAdTraek-stathmin1基础上成功构建突变克隆载体pAdTrack-stathmin1-mut，并经测序鉴定。 4、脂质体法转染stathmin1克隆载体、突变载体以及RNA干扰载体到正常人黑色素细胞以及人鼻咽癌CNE-2细胞株中。分别观察过表达、沉默或突变体stathmin1对CNE-2细胞以及黑色素细胞生长的影响。MTT法绘制不同stathmin1表达状态下细胞的生长曲线，Hoechst33258以及溴化乙啶(ethidiumbromide，EB)分别染色以及流式细胞仪检测细胞凋亡率改变，并对黑色素细胞特有功能进行检测。RT-PCR以及Westernblot结果显示干扰载体以及过表达载体能有效的在mRNA水平和蛋白质水平改变stathmin1的表达。间接免疫荧光法对CNE-2细胞β-Tubulin染色，激光共聚焦显微镜观察细胞骨架形态改变。stathmin1的异常表达可以造成细胞生长明显受抑，凋亡率显著增加，基于微管的细胞骨架明显受到破坏，黑色素产量以及酪氨酸酶活性明显降低。 结论以及研究意义： 1、EB病毒永生化的正常人B淋巴细胞生长旺盛，能不断传代，可以作为一种细胞模型用于某些疾病资料的保存。 2、对质粒pBluescriptIIKS(+)荧光化改造成功，可以直接用于构建针对其它基因的RNA干扰载体；正负向表达调控质粒能有效改变stathmin1在细胞内的表达水平，说明RNA干扰靶点的选择是基因特异的，3’端非翻译区也可以存在有效靶点；突变载体和过表达载体转染的细胞stathmin1表达水平接近，表明C端三个氨基酸突变不会影响stathmin1的抗原表位。 3、stathmin1的正常表达对于人鼻咽癌CNE-2细胞的生长增殖至关重要，为鼻咽癌治疗的研究提供新的靶点，stathmin1表达水平改变可以造成黑色素细胞生长受抑、黑色素产量减少；C末端三个氨基酸的改变不能对stathmin1的生物学功能造成明显影响，为stathmin1的结构-功能研究丰富了资料。