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ChaB是假定的大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)ChaA的调节子,其存在于细菌、古细菌及杆状病毒(Baculovirus)中的同源物构成了一个多基因家族。目前chaB基因在杆状病毒中的功能未知。本文选取甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodopteraexiguamulticapsidnucleopolyhedrovirus,SeMNPV)基因组中的两个EcolichaB同源基因即:开放阅读框100和101(openreadingframe100and101,ORF100andORF101)(分别命名为Se100和Se101基因)和苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus,AcMNPV)基因组中的两个chaB基因即:ORF59和ORF60(分别命名为Ac59和Ac60基因)为研究对象,对这些基因的转录、翻译特征、蛋白在病毒结构中的定位、核酸结合能力等进行了系统研究,并就基因缺失对病毒侵染的影响等进行了初步研究。
Se100基因位于基因组的99254-99523nt之间,该阅读框长270bp,编码90个氨基酸,预期分子量为10.325kDa;Se101基因位于基因组的99537-100124nt之间,阅读框长588bp,编码196个氨基酸,预期分子量为23.027kDa;Ac59基因位于基因组的47882-48091nt之间,阅读框长210bp,编码70个氨基酸,预期分子量为8.173kDa;Ac60基因位于基因组的48103-48366nt之间,阅读框长264bp,编码88个氨基酸,预期分子量为10.147kDa。序列分析表明,这些基因编码的蛋白保守的N-端都含有一个约为60个氨基酸组成的、疏水的ChaB结构域。据此,我们称这些蛋白为杆状病毒ChaB蛋白。
基于ChaB完整结构域的进化分析表明,用于建立系统树的43种ChaB蛋白可以分成四个不同的组,分别是:细菌组,颗粒体病毒(granulosisvirus,GVs)组,组Ⅰ(groupⅠ)核多角体病毒(nuclearpolyhedrosisvirus,NPVs)和组Ⅱ(groupⅡ)NPVs。Se101、Ac59属于groupⅠNPVs,Se100、Ac60属于groupⅡNPVs。
RT-PCR分析结果表明,Se100和Se101基因在病毒感染细胞中的转录均从24h开始可以检测到,一直持续到感染后96h;而Ac59和Ac60基因在病毒感染细胞中的转录则从12h开始就可以检测到,一直持续到感染后72h。5RACE分析发现,Se100和Se101基因转录分别起始于ATG上游9nt和12nt的杆状病毒晚期启动子ATAAG中的第一个嘌呤碱基A,与计算机预测的晚期启动子位置一致;Ac59基因转录起始于ATG上游238nt的杆状病毒晚期启动子ATAAG中的第一个嘌呤碱基A,与计算机预测的晚期启动子位置一致;而Ac60基因的转录则起始于ATG上游27nt的CAAAG中的碱基A。
参照SeMNPV全基因组序列中Se100和Se101基因全长序列设计2对引物,进行PCR扩增,将得到的这两个基因克隆至pQE30表达载体上,在原核细胞中实现了基因的融合表达。同样用PCR方法将Ac59和Ac60两个基因分别克隆到原核表达载体pET32a(+)和pET28a(+)上也实现了两个基因的融合表达。将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备了四种蛋白的多克隆抗体。以获得的抗体对感染SeMNPV不同时间的Se301细胞进行Westernblot检测,发现在感染后48-96h的细胞中均有一条大小为11kDa的特异蛋白带能与Se100抗体发生特异性反应,这一大小与理论分子量相符,该蛋白从48h开始可以检测到,是一个晚期表达的蛋白;Se101蛋白也是从感染后48h可以检测到并持续到96hp.i.,表明该蛋白也是一个晚期表达的蛋白,但是检测到的约28kDa的特异蛋白条带比预期的(23.03kDa)偏大,推测可能是发生了某种翻译后的修饰。以获得的抗体对感染AcMNPV不同时间的Sf9细胞进行Westernblot分析表明,对于Ac59抗体分别有一条约为38kDa和一条约为25kDa的蛋白带能与其反应,其中38kDa带从12h就可以检测到,并一直持续到72h,而25kDa的蛋白带则从24h才可以检测到并一直持续到72h,两条杂交带均远远大于推测的蛋白分子量(8.17kDa);对于Ac60抗体分别有一条约为33kDa和一条约为17kDa的蛋白带能与其反应,其中33kDa带从12h就可以检测到,并一直持续到72h,而17kDa的蛋白带则从24h才可以检测到并一直持续到72h,同样两条阳性反应蛋白带也比预期的理论分子量(10.147kDa)大,推测可能是由这些蛋白本身所固有的特性所致,或者发生了某些翻译后修饰,更或者是形成了二聚体或多聚体。
通过Westernblot和双色间接免疫荧光分析发现,在病毒感染的晚期,Se100、Se101蛋白和Ac59、Ac60蛋白均存在于细胞核和细胞质中。四种蛋白均定位于包涵体来源型病毒粒子(occlusion-derivedvirus,ODV)的核衣壳上,是ODV-特异的核衣壳蛋白。对分别感染SeMNPV和AcMNPV的细胞进行核组分的分离抽提发现,Se100和Se101蛋白主要是作为可溶性蛋白及与基因组DNA具有中等结合活性的核蛋白存在,也有可能与细胞的核结构有关;Ac59和Ac60蛋白可能与细胞的核结构紧密相关。柱层析结果表明,SeMNPVChaB能够较弱地与DNA结合,AcMNPVChaB也能够与DNA结合,四种蛋白对ssDNA的结合能力比对dsDNA的结合能力稍强。
在AcMNPV基因组中同时存在着两个方向相同的chaB基因,即orf59和orf60基因。本文采用ET-克隆技术在大肠杆菌DH10Bac-pBAD细胞中成功实现了从AcMNPVBacmid基因组敲除靶基因Ac59、Ac60和Ac59-60,并同时在靶位点插入氯霉素基因Cm。为了更直接的观察chaB基因可能对病毒侵染产生的影响,将gfp基因和多角体基因作为双标记基因,通过Bac-to-Bac系统的转座作用插入AcΔ59/60/59-60,构建基因缺失型重组BacmidAcΔ59/60/59-60-PG。置于早期启动子ie-l下表达的GFP荧光蛋白用以指示重组病毒芽生型病毒粒子(buddedvirus,BV)在离体细胞中的传播,多角体蛋白则用来指示重组病毒在离体细胞中感染的进程。显微观察显示,缺失型的重组病毒转染的Sf9细胞中绿色荧光的扩散滞后于野生型病毒转染的细胞,多角体变化的趋势与绿色荧光的变化趋势相似。靶基因chaB敲除后的重组病毒仍然具有感染性,但感染性病毒粒子产生的速度大大滞后,综合这些结果,说明AcMNPVchaB基因并不是病毒复制的必需基因,但能够加速病毒的感染周期。