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临床研究及实验表明,基因治疗的关键在于载体的选择。发展至今,不同时期已有多种不同的载体应用于基因治疗中,如逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒及腺相关病毒载体等。各种载体都具有各自的优点及缺陷。腺病毒载体的结构及功能研究较为清楚,因其致病原性低,宿主范围广泛,包装生产简单,可同时表达多个基因等优势在基因治疗中被广泛应用;但是腺病毒同样存在靶向性差,表达外源基因时间短,容易引起较为强烈的免疫反应等诸多缺陷。目前国际上较为公认的腺相关病毒（AAV）载体可以在一定程度上弥补这些不足。AAV对人体免疫原性低,几乎无致病性,可介导目的基因长效表达,并且宿主范围极为广泛,能感染不同细胞周期的多种类型细胞。已发现的AAV血清型至少有150多种,不同血清型的AAV可以靶向不同的细胞和组织,进一步扩大了AAV的应用范围。AAV1因其可以高效靶向骨骼肌,携带外源基因应用于临床研究和治疗更为安全,已经越来越多的被作为基因治疗载体用于多种疾病的治疗。但是临床研究对AAV1的需求量极高,一般滴度要达到1017VG/ml。传统的质粒转染生产方式所得到的AAV容易被腺病毒污染,并且耗时耗力,过程繁琐,实际操作很难达到临床需要的用量。本研究采用二杆状病毒-昆虫细胞生产系统,期望探索出一套rAAV1规模化包装生产的稳定方法。杆状病毒能够为AAV的复制包装提供必要的辅助元件,并且杆状病毒不会像腺病毒和单纯疱疹病毒一样对人体产生毒性,又借助对昆虫细胞Sf9的感染性,在昆虫细胞中悬浮生产重组AAV载体,是一种较为理想且能满足临床需求的新型重组AAV生产方式。本研究首先构建完成了三个携带了AAV包装所需的顺式和反式作用元件的重组pFastBacDual质粒:pFBD-AAV1RepiCapi和pFBD-AAV1RFP、pFBD–AAV1AT7（Avastin）;利用重组pFastBacDual质粒转化DH10TMBac感受态菌株,获得Bac-AAV1RepiCapi和Bac-AAV1RFP、Bac-AAV1AT7 （Avastin）,滴度分别为5.42×108VG/ml、2.63×108 VG/ml、5.95×1012VG/ml;采取二杆状病毒系统成功包装出重组AAV病毒rAAV1RFP、rAAV1- AT7（Avastin）,rAAV1-RFP。100ml锥形瓶中包装出的rAAV1-RFP病毒产量为3.7×1013vg,可达35TU/Cell,生产能力较强;利用rAAV1-RFP感染细胞,荧光显微镜下观察红色荧光效果理想;运用ELISA手段检测rAAV1-AT7（Avastin）不同时间抗体表达量,抗体均有所表达,说明本研究已经探索出一套利用二杆状病毒系统包装生产rAAV1的方法,包装出的病毒均具有生物学活性,并能够实现外源基因的体外表达,后续进一步放大生产规模,即可生产出满足临床需求的rAAV1。