目的:糖基化是蛋白质最常见的翻译后修饰过程。异常糖基化在人类恶性肿瘤的发生与发展中起至关重要的作用。糖基化是将糖类与其他糖、蛋白质或脂质催化形成糖苷键的过程。通常,将糖基化根据多糖与蛋白之间形成糖苷键的起始过程发生的基团不同分类为:N-糖基化或O-糖基化两大类。N-连接糖基化中,糖链通过与新生肽链中特定天冬酰胺的自由-NH₂基链接,其过程发生在内质网与高尔基体,通过寡糖基转移酶复合体催化完成;O-链接糖基化又主要分为Mucin-type O-糖基化和O-glcnac糖基化,O-糖基化中糖链连接于肽链中的丝氨酸/苏氨酸的-OH基,其过程发生于高尔基体,分别通过N-乙酰氨基半乳糖转移酶或N-乙酰氨基葡萄糖转移酶催化起始。而根据末端修饰的基团不同,最广泛发生的恶性肿瘤相关糖基化又主要分为:唾液酸化、O-聚糖截短和岩藻糖基化等。粘蛋白型O-糖基化为蛋白O-糖基化的最常见、最重要类型,其起始步骤由多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶（N-acetylgalactosaminyltransferases,GALNTs,GalNAc-Ts）催化,将GalNAc连接至糖蛋白的丝/苏氨酸残基上。这一修饰过程发生于高尔基复合体,受GALNT家族成员表达与分布的调控。已有研究证实,异常的Mucin-type O-糖基化在细胞增殖、凋亡、分化、粘附、迁移、侵袭、血管形成及入侵免疫系统等过程中发挥关键调节作用,乃至影响多种恶性肿瘤的复发与预后。近期报告中GALNTs被证实在恶性肿瘤中异常表达,且与不良预后显著相关。GALNTs表达失调在不同的恶性肿瘤中可能发挥相同或截然相反的作用。GALNT6表达与肺腺癌TNM分期呈显著正相关,并可作为预测其较差OS的独立预后因素,而在胰腺癌中,GALNT6高表达却是提示预后良好的独立预后因素。利用在线肿瘤基因表达谱芯片数据库ONCOMINE分析所有GALNTs在多种恶性肿瘤中表达情况,GALNT6在结肠癌组织显著高表达,其表达增高幅度及其在各个数据集中的一致性,是所有GALNTs在所有恶性肿瘤中最显著的。然而GALNT6在结肠癌中与预后的相关性及对细胞恶性生物学行为的影响目前均尚无报告。肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）存在于血液肿瘤与实体恶性肿瘤,是具有自我更新与多向分化潜能的肿瘤细胞亚群。这些小群体的细胞赋予肿瘤耐药与转移的能力,是肿瘤发生发展的关键。防止复发和转移的关键是确定调节维持CSCs及其自我更新的分子靶点。醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenases,ALDHs）在多种实体恶性肿瘤及血液恶性CSCs中高表达,是广泛的干细胞标志物。已有报告指出,GALNTs介导的粘蛋白型O-糖基化通过促进或抑制干细胞通路中关键因子的活化,调节膀胱癌、乳腺癌、肝细胞癌干细胞的自我更新能力,这提示GALNTs与肿瘤CSCs的干细胞性有关。GALNT6及其他GALNTs成员与结肠CSCs之间的关系,以及与CSCs分子标记物,如CD44,ALDH等之间的关系,目前尚未见报告。GALNTs通过改变蛋白糖基化水平,影响其活化或下游信号通路变化。SWISS-PROT数据库的分析预测所有蛋白质中超过50%的蛋白存在糖基化。然而仅少量GALNTs底物蛋白在影响癌症恶性表型中被验证。目前已有研究在不同癌症类型中报告了GALNTs表达差异具有蛋白表达谱变化。关于GALNT6已有研究报告指出GALNT6通过粘蛋白型O-糖基化活化并稳定粘蛋白1（Mucin 1,MUC1）的表达,从而促进乳腺癌发生。以小干扰RNA敲减GALNT6能够显著促进乳腺癌细胞粘附,抑制细胞增殖。GALNT6同样可以促进纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）的粘蛋白型O-糖基化,使乳腺MCF10A细胞系在GALNT6过表达时表现出侵袭增强的特征,在3D培养系统中促进对完好腺泡结构的破坏。然而在MUC1与FN表达均不占优势的三阴性乳腺癌细胞中GALNT6是否同样能够发挥类似功能,且是否有其他一种或多种底物蛋白参与其中尚为未知。作为与恶性肿瘤密切相关的糖基化类型,异常的岩藻糖基化在包括肺腺癌在内的多种恶性肿瘤的增殖、凋亡、迁移、侵袭、血管生成及耐药过程中均发挥重要作用。岩藻糖基转移酶4（fucosyltransferase IV,FUT4）为合成肿瘤相关糖类抗原的关键酶,催化L-岩藻糖由GDP-岩藻糖向底物的转移过程,从而参与Lewis A,B,X与Y的合成。FUT4在包括白血病、胃癌和乳腺癌等恶性肿瘤中高表达,与肿瘤进展密切相关,但FUT4与癌症预后关系的报告迄今甚少。早期有研究报告FUT4和/或FUT7在基因水平表达上调与肺癌缩短的生存期呈正相关。但由于分期系统及治疗策略在二十多年间已发生了剧变,有必要对FUT4在肺腺癌中的预后作用进行重新评价。基于在线肿瘤基因表达谱数据库ONCOMINE中GALNT6在多种恶性肿瘤中的表达情况,有绝对多数量研究显示GALNT6在结肠癌与乳腺癌中高表达的结果,本论文第一、二部分分别研究GALNT6在结肠癌、乳腺癌组织中表达情况及其预后价值,并以结肠癌细胞系RKO、HCT-116以及乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7与MDA-MB-468为研究对象,研究GALNT6影响结肠癌、乳腺癌恶性表型的作用,利用在线数据集推测GALNT6在结肠癌中调节的重要信号通路,通过糖基化组学方法评价GALNT6在乳腺癌中调节上清中新底物的粘蛋白型O-糖基化,分别在分子水平对GALNT6促进结肠癌、乳腺癌恶性表型的机制进行了探讨与验证。第三部分研究通过在线数据评价FUT4在肺腺癌中的预后作用,利用生物信息学方法推测FUT4调控肺腺癌机制的重要信号通路,同时采用病理标本对肺腺癌预后及机制进行了免疫组化验证。研究方法:1、利用在线数据集ONCOMINE评价GALNT6在结肠癌与正常组织中mRNA表达水平,利用TCGA数据库评价FUT4在肺腺癌与正常组织中mRNA表达水平。2、利用在线数据集SurvExpress数据进行荟萃分析,评价GALNT6在结肠癌、乳腺癌中GALNT6与OS及DFS关系,利用TCGA及Kaplan-Meier Plotter数据库预测及在线验证FUT4与肺腺癌OS关系。3、采用本医院肺腺癌队列,利用免疫组化方法验证FUT4在肺腺癌中的表达及预后作用。4、FUT4与临床病理学参数的相关性分析。5、FUT4与临床病理学参数对肺腺癌预后的单因素与多因素分析,并构建列线图及校正曲线。6、利用TCGA数据集结肠癌与肺腺癌数据进行基因集富集分析（Gene set enrichent analysis,GSEA）,寻找GALNT6与FUT4差异表达相关的KEGG通路。7、利用TCGA数据进行FUT4与免疫抑制分子的相关性分析。8、采用本医院肺腺癌队列验证,利用免疫组化方法验证FUT4与免疫抑制分子PD-1相关性。9、构建靶向GALNT6基因的化学合成siRNA和过表达真核质粒载体,转染结肠癌、乳腺癌细胞系。10、构建靶向沉默和过表达GALNT6基因的慢病毒表达载体,建立稳定转染的结肠癌、乳腺癌细胞系。11、MTT法测定细胞活力。12、集落形成实验观察处理前后细胞克隆的形成。13、Transwell法检测细胞迁移与侵袭能力。14、利用Lipofectamine 2000试剂瞬时转染GALNT6的siRNA。15、流式细胞术检测细胞CD44⁺ALDH⁺细胞表达。16、Real-time PCR技术检测ALDH1A1,ALDH1B1,ALDH2,ALDH5A1,ADLH6A1,ALDH7A1等mRNA表达水平。17、Western blot检测GALNT6,AKT,p-AKT,E-cadherin,Vimentin,ZEB1,slug和β-actin等蛋白的表达。18、VVA免疫沉降技术检测底物蛋白糖基化水平。19、所有数据采用3次独立实验结果,以均值±标准差（x±s）进行表示。采用SPSS 17.0统计分析软件进行统计学分析。组间比较采用t检验,P<0.05有统计学意义。结果:1、在线数据集ONCOMINE结果提示,大量研究表明GALNT6在结肠癌组织中的mRNA水平显著高于正常组织。2、利用在线数据集SurvExpress中结肠癌相关研究进行荟萃分析,结果提示GALNT6高表达与结肠癌较差的OS与DFS呈显著正相关。3、MTT与集落形成实验结果提示沉默GALNT6可抑制结肠癌细胞增殖,过表达GALNT6可促进结肠癌细胞增殖。4、细胞迁移实验发现,与对照组相比,沉默GALNT6后结肠癌细胞迁移能力下降,而过表达GALNT6后结肠癌细胞迁移能力增强。提示GALNT6具有促进结肠癌细胞转移的作用。5、利用TCGA结肠癌数据集进行GSEA以明确GALNT6高表达导致结肠癌不良预后的分子机制。GSEA结果提示GALNT6高表达与KEGG_缬氨酸_亮氨酸_异亮氨酸降解通路,KEGG_丙酸代谢通路,KEGG_O多糖合成通路及KEGG_丁酸甲酯代谢通路等四个通路呈正相关。6、GSEA结果提示,GALNT6高表达通过促进CSCs标记物ALDH1B1,ALDH2,ALDH5A1,ALDH6A1,ALDH7A1等ALDHs表达进而促进结肠癌细胞恶性表型,提示GALNT6表达可能与结肠癌干细胞性有重要相关性。Real-time PCR实验检测过表达GALNT6前后结肠癌细胞ALDHs家族成员mRNA水平变化,均显著上调,与GSEA所得结果一致。流式细胞术检测结果提示,过表达GALNT6前后结肠癌HCT-116细胞CD44⁺/ALDH1A1⁺干细胞亚群所占比例显著上调。以上研究显示,GALNT6具有促进结肠癌干细胞性的能力。7、在线数据集ONCOMINE结果提示,大量研究表明GALNT6在乳腺癌组织中的mRNA水平显著高于正常组织。8、利用在线数据集SurvExpress中乳腺癌相关研究进行荟萃分析,结果提示GALNT6高表达与乳腺癌较差的OS呈显著正相关。9、MTT与集落形实验发现,与对照组相比,沉默GALNT6后乳腺癌细胞增殖能力下降,提示GALNT6具有促进乳腺癌细胞增殖的作用。10、Transwell实验发现,与对照组相比,沉默GALNT6后乳腺癌细胞迁移、侵袭能力下降,提示GALNT6具有促进乳腺癌细胞转移的作用。11、细胞迁移实验发现,与对照组相比,沉默高表达细胞GALNT6后其上清促进低表达细胞迁移能力的能力下降,提示GALNT6高表达细胞上清能够促进GALNT6低表达细胞的迁移能力。12、Western blot检测上皮与间质表型标志物表达情况,沉默GALNT6的MDA-MB-231细胞较NC组E-cad表达显著上调,Vimentin表达下调。转录因子ZEB1,Slug表达显著下调,提示GALNT6高表达通过促进EMT促进MDA-MB-231细胞转移。13、Western blot检测信号通路活化情况,与对照组相比,沉默GALNT6后PI3K/AKT信号通路活性明显受抑,提示GALNT6通过促进AKT活化促进乳腺癌细胞增殖与转移。14、沉默GALNT6导致乳腺癌Mucin-type O-糖基化水平显著下调。15、MDA-MB-231细胞株上清分泌蛋白的定性糖基化组学分析结果提示,AHSG、角蛋白、α2Μ与CBFA2T2等糖蛋白可能为GALNT6促进乳腺癌恶性表型的重要底物蛋白。16、在线数据集TCGA数据结果提示,FUT4在肺腺癌组织中的mRNA水平显著高于正常组织。17、利用在线数据集TCGA数据进行分析,结果提示FUT4高表达与肺腺癌较差的OS呈显著正相关,并在另一在线数据集Kaplan-Meier Plotter中得到了在线外部验证。18、本医院肺腺癌队列免疫组化结果提示,FUT4在肺腺癌中的表达与肺腺癌较差的OS呈显著正相关。19、FUT4与临床病理学参数的相关性分析结果显示,在本院肺腺癌队列中,FUT4与pN分期和pTNM分期呈显著正相关。20、FUT4与临床病理学参数对肺腺癌预后的单因素与多因素分析,结果提示FUT4与pT分期和pTNM分期结果一致,均为肺腺癌的独立预后因素,列线图及校正曲线证实FUT4能够有效预测肺腺癌的预后。21、TCGA数据基因集富集分析结果提示,FUT4与ERBB通路及多个免疫通路呈显著相关性。22、TCGA数据结果显示FUT4与增殖标志物Ki67,免疫抑制分子PD-1,及MDSC与Treg标志物呈显著正相关。23、本医院肺腺癌队列免疫组化验证FUT4与PD-1呈显著正相关。结论:1、GALNT6在结直肠癌与乳腺癌组织中高表达,FUT4在肺腺癌组织中高表达,并提示相应恶性肿瘤不良预后。2、FUT4为预测肺腺癌患者预后不良的独立标志物。3、GALNT6促进结肠癌与乳腺癌细胞增殖与转移。4、GALNT6能提高ALDHs表达,并提高ALDH⁺CD44⁺CSCs比例,促进结肠癌增殖与转移。5、GALNT6高表达能促进α2M,AHSG等分泌蛋白Mucin-type O-糖基化。6、GALNT6能活化PI3K/AKT通路,促进乳腺癌细胞EMT,促进乳腺癌细胞增殖与转移。7、FUT4很可能通过PD-1相关免疫抑制导致肺腺癌预后不良。