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突触传递是神经系统实现功能最基本的方式。神经末梢突触前膜通过突触囊泡(synaptic vesicles,SV)存储和释放神经递质,保证神经信号的正常传导。之后突触囊泡元件通过内吞作用回收,突触囊泡开始新一轮的循环过程。在本课题研究中,我们使用秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)作为模式生物。秀丽线虫神经系统解剖结构十分简单,只有302个神经元,神经元及主要的突触连接已经被阐明,而且大部分基因和高等动物同源,因此是适合研究高等动物神经系统的最简单模型。我们希望通过线虫全基因组的RNAi筛选找到调控突触囊泡循环的新基因,并阐述清楚该基因的调控机制。
我们用在神经系统中稳定表达融合蛋白SNB-1::pHluorin(SpH)的RNAi敏感型线虫作为本筛选的探针线虫。采用喂食线虫RNAi大肠杆菌的方法来沉默基因。我们将线虫培养在96孔板中,并使用流式线虫仪(complex object parametricanalysis and sorter, COPAS)对线虫进行高通量的荧光强度的测量。我们将线虫全基因组RNAi文库进行了筛选,覆盖的基因范围超过了线虫基因组90%以上的基因。通过多次筛选验证,最终确定了SpH荧光上调的基因177个和荧光下调的基因97个,87%的基因在进化上是保守的。我们在实验中发现一个未知功能基因:B0035.1/ZNF207,具有锌指蛋白C2H2结构域,其突变体在各项实验指标中都显著区别于对照组,包括运动轨迹减小且运动速率减慢,具有显著的aldicarb抵抗性,SNB-1在轴突定位有缺陷,内源兴奋性突触后电流频率降低以及去极化刺激唤醒的突触后电流减小等特征。因此我们推测B0035.1在神经系统中发挥重要作用,并且能够促进神经递质的释放。
本论文的第二个部分为线虫基因C13C4.5对脂滴调控的研究。脂滴是生物体内脂质存储的主要场所,从原核生物细菌到高等动物人都有脂滴的存在。脂代谢的异常会导致如糖尿病在内的多种代谢类疾病。C13C4.5在人类中的同源基因为Spinster,已报道与溶酶体异常,自噬溶酶体的再形成相关。我们在研究中发现C13C4.5基因敲除线虫脂滴大小、脂肪含量与野生型相比有了显著降低,而且晚期内体,溶酶体形态都发生了异常。这是第一次报道此基因对脂滴有调控作用。此外,我们发现C13C4.5突变体后代存活率显著低于野生型,可能与脂代谢异常有关。因此我们提出假设:C13C4.5通过改变溶酶体的形态和功能来调节脂肪含量和脂滴大小,从而进一步影响后代存活率。