【摘 要】
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第一部分骨髓间充质干细胞及其外泌体的提取与鉴定目的:分别提取骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）及其外泌体（exosomes）并对其进行鉴定。方法:使用全骨髓贴壁法提取BMSCs,在显微镜下观察提取细胞的形态特征并用流式细胞仪检测BMSCs的表面标记。使用外泌体提取试剂盒从BMSCs培养基上清中提取外泌体,使用透射电镜、粒径分析以及检
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第一部分骨髓间充质干细胞及其外泌体的提取与鉴定目的:分别提取骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）及其外泌体（exosomes）并对其进行鉴定。方法:使用全骨髓贴壁法提取BMSCs,在显微镜下观察提取细胞的形态特征并用流式细胞仪检测BMSCs的表面标记。使用外泌体提取试剂盒从BMSCs培养基上清中提取外泌体,使用透射电镜、粒径分析以及检测蛋白标记物进行外泌体鉴定。结果:提取的BMSCs在镜下呈纺锤形,BMSCs的表面抗原CD29、CD90、CD34和CD45的阳性率分别为97.79±1.85%、99.50±0.42%、0.88±0.03%和1.71±0.07%。透射电镜观察到BMSCs来源外泌体（BMSCs-Exos）形态大致成圆形或椭圆形,粒径分析测定外泌体的直径为40-120nm（平均直径100.25±15.36nm）,同时提取的外泌体表达特异性的外泌体蛋白标记物CD9、CD81和Alix。结论:我们成功提取了BMSCs以及BMSCs来源的外泌体,可以用于后续的实验。第二部分缺氧预处理骨髓间充质干细胞来源的外泌体对心肌缺血再灌注损伤的保护作用目的:探索缺氧预处理骨髓间充质干细胞来源的外泌体对大鼠心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI）的保护作用。方法:我们建立大鼠心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）模型,并于再灌注期间注射常氧培养BMSCs来源外泌体（N-Exos）和缺氧预处理BMSCs来源外泌体（H-Exos）进行治疗。使用Tunel染色和Western blot检测受损心肌的凋亡情况,并使用小动物超声测定心功能。结果:与假手术组相比,I/R组受损心肌组织细胞凋亡率明显升高（19.00±1.00%）、凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3表达升高、左室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）由74.33±3.06%降低至26.67±3.06%;加入N-Exos进行处理后,与I/R组相比,I/R诱导的细胞凋亡率明显降低（12±1.00%）、cleaved-caspase-3表达显著降低、LVEF降低明显改善（40.00±2.00%）;而与N-Exos相比,加入H-Exos进一步降低了细胞凋亡率（8.67±0.58%）、cleaved-caspase-3的表达、改善LVEF降低（46.33±1.53%）。结论:BMSCs-Exos对大鼠MIRI具有保护作用,能抑制心肌细胞凋亡和改善心功能,而将BMSCs进行缺氧预处理能进一步增强其外泌体的心脏保护作用。第三部分缺氧预处理骨髓间充质干细胞来源的外泌体对H9C2细胞缺氧复氧损伤的保护作用及其机制目的:探索缺氧预处理骨髓间充质干细胞来源的外泌体抑制缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）诱导H9C2细胞凋亡的机制。方法:使用Dil标记外泌体与H9C2共培养,验证外泌体能够被H9C2内化摄取。通过体外建立H9C2缺氧复氧损伤模型模拟MIRI。采用Annexin V-FITC/PI法检测不同缺氧复氧时间的H9C2细胞凋亡率,以选定最佳缺氧复氧时间。通过检测细胞活力和LDH释放确定最佳的外泌体浓度。使用PI3K/AKT抑制剂LY294002处理H9C2以验证PI3K/AKT通路在外泌体抗凋亡中的作用。最后使用细胞活力、LDH释放、Annexin V-FITC/PI法、Western blot方法测定外泌体的抗凋亡作用和PI3K/AKT通路的作用。结果:Dil标记的外泌体可以在细胞核周围观察到,即外泌体可以被H9C2细胞内化摄取。缺氧16小时、复氧24小时组细胞凋亡率显著上调,故选择缺氧16小时、复氧24小时作为最佳缺氧复氧时间。外泌体浓度达到400μg/ml时与缺氧复氧组细胞活力、LDH释放差异有统计学意义,故选择400μg/ml作为最佳外泌体浓度。与H/R组相比,H/R+N-Exos组H9C2的细胞活力显著增加、LDH释放显著减少、细胞凋亡率显著降低、凋亡相关蛋白表达显著减少。而与H/R+N-Exos组相比,H/R+H-Exos组进一步增强了这些保护作用,但在加入LY294002后显著抑制了H-Exos对H9C2细胞的保护作用。结论:BMSCs-Exos可以抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡,而H-Exos可以通过进一步激活PI3K/AKT通路增强抗凋亡作用。
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