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玉米(Zea mays L.)是世界上重要的农作物,是重要的粮食、饲料和工业原料。玉米籽粒主要分为三部分:母本组织、胚乳和胚。胚乳占据了种子的大部分体积,其中贮存的营养物质主要有碳水化合物、脂肪、蛋白质、半纤维素和油脂等。淀粉是碳水化合物基本贮藏形式,占胚乳的60%~80%。淀粉的合成涉及到许多酶,包括蔗糖合成酶(SUS)、ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SSs)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(DBE)等,这些酶相互协同、相互影响,合成不同结构和数量的淀粉。Opaque 2(O2)蛋白在玉米胚乳生长发育及代谢调控中发挥重要作用。研究表明O2蛋白可能参与淀粉合成代谢调控。本实验以构建好的o2近等基因系CAL58与CAL58/o2为材料,通过荧光定量PCR、瞬时表达、酵母单杂交手段进一步分析证实O2蛋白在淀粉合成途径中的调控作用,以期为育种实践中应用o2培育优质蛋白玉米(QPM)提供理论支撑。本文的主要研究结果如下:1.针对前期筛选出的差异蛋白点以及RNA-Seq中的差异表达基因,对CAL58与CAL58/o2近等基因系在10 DAP(Days after pollination,DAP)、14 DAP、18 DAP、22 DAP和26 DAP的籽粒胚乳进行基因表达量分析。结果表明,CAL58中Sh1、Sh2在10 DAP~18 DAP表达量增加,SSIV在10 DAP~22 DAP表达量增加,达到峰值后表达量下降。18 DAP~22 DAP是胚乳中淀粉合成的关键期,淀粉颗粒在这个期间大量合成,表明这三个基因在淀粉合成中起重要作用。2.进一步以Sh1、Sh2及SSIV基因启动子序列构建报告载体,以PRI101-AN-O2融合质粒为效应载体,在拟南芥原生质体中瞬时表达。通过对荧光信号的分析,表明O2蛋白对Sh1转录表达有显著激活作用,对Sh2、SSIV转录表达有显著抑制作用。由于Sh2、SSIV基因启动子本身活性不高,O2蛋白对其抑制作用需进一步分析。3.分析Sh1、Sh2及SSIV基因的启动子,以O2 box(ACGT)为核心设计靶位点,构建报告载体,以PGADT7-O2为表达载体,进行酵母单杂交实验。目前实验结果表明,O2蛋白可结合在Sh1启动子区-724 bp~-694 bp处,说明O2蛋白可能直接调控Sh1基因表达;另外金担子素(AbA)不能抑制部分候选靶位点融合载体的背景表达,O2是否直接调控Sh2、SSIV的表达需要进一步分析。全文研究表明,o2基因突变导致籽粒发育关键时期Sh1、Sh2及SSIV表达量发生显著变化;体外实验发现O2蛋白可能直接结合在Sh1启动子上激活其转录表达,同时抑制Sh2、SSIV基因转录,参与淀粉合成过程,从而造成淀粉含量的差异积累。本研究有利于进一步认识O2的功能及生物学意义,对于完善O2蛋白调控网络意义重大。