牙鲆(Paralichthys olivaceus)肉质鲜美、营养丰富，是我国北方沿海地区大规模养殖的经济海产鱼类之一。但随着近年来养殖规模的扩大，牙鲆腹水病、病毒性神经坏死症等各种病害的爆发和流行给生产企业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了牙鲆养殖产业的发展。由于对牙鲆免疫机理和机制的了解较少，尚无有效的免疫防治技术和方法，仍然采用化学药物和抗生素等传统的方式来控制病害的发生。但长期使用抗生素使病菌的抗药性越来越强，并且大量的药物残留严重破坏了生态环境,食用鱼的安全性也受到了影响。外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，是鱼类体液免疫的重要组成部分，在鱼类特异性免疫和非特异性免疫过程中起着重要作用。目前对于牙鲆单个核细胞的免疫功能研究尚属起步阶段，尚不清楚其作用机制。本研究以养殖牙鲆为材料，对外周血单个核细胞进行离体培养和细胞学观察，同时对单个核细胞的吞噬功能和细胞膜表达离子通道的电生理特征进行了观察。为建立牙鲆血细胞离体培养技术和探究细胞免疫功能奠定基础。 通过对牙鲆外周血细胞的分离鉴定，确定单个核细胞的形态特征,用密度梯度离心的方法，分离出纯净的单个核细胞层细胞，分析不同因素对细胞离体存活和生长的影响，优化营养条件和培养条件，建立离体细胞培养方法。并对离体培养的淋巴细胞和单核细胞进行细菌吞噬实验和膜表达离子通道研究，主要研究结果和结论如下： 1.通过对牙鲆外周血进行染色，可在光镜下鉴别出红细胞、血栓细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、和嗜碱性粒细胞7种细胞。利用细胞分层液(比重为1.083)，20℃，水平离心3000r／min，15min，Hanks溶液洗涤，可得纯净的单个核细胞。 2.离体培养的单个核细胞在含20％胎牛血清、终浓度100U／ml青霉素和链霉素、终浓度为O．5mmol／L谷氨酰胺、添加PHA(30μg／ml)的M199培养液中，于25℃，24孔培养皿(Costar，美国)中能够贴壁生长传至6代，存活30天以上。贴壁生长的单核细胞形状不规则，长径11.05±0.91μm，短径9.55±1.39 μm；淋巴细胞近似呈圆形，长径7.31±1.05μ m，短径6.13±0.97μm。均呈鹅卵石状紧密排列，并有接触性抑制现象，长满单层时细胞会脱壁悬浮。 3.将离体培养传至第二代(7d)的单个核细胞用于金黄色葡萄球菌吞噬实验。单核细胞在发生吞噬时，细胞常通过变形运动把细菌包裹至细胞内，吞噬率(PP)和吞噬指数(PI)分别为(61.9±3.05)％和1.58±0.51。淋巴细胞常见到细菌粘到细胞表面，吞噬率(PP)和吞噬指数(PI)分别为(42.1±2.33)％和3.17±1.57。 4.单个核细胞膜上存在的离子通道，在控制细胞膜的静息电位，调节细胞体积和在细胞活化中均起着重要作用。膜片钳研究结果表明，牙鲆单核细胞适宜进行膜片钳研究，记录的细胞均表达电压门控钠、钾、钙离子通道。为今后开展单核细胞表达离子通道的种类和特征研究及其在细胞免疫中的作用奠定了基础。