海生杆菌合成聚羟基脂肪酸酯的研究

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聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)是一类由微生物合成的高分子材料,有着与传统石油基塑料相近的材料学性能,同时还具备生物可降解性和生物相容性,是石油类塑料的理想替代品。当前,较高的生产成本限制了PHA的产业化应用,挑选产量较高的PHA生产菌株、使用价格低廉的发酵底物及对生产菌株进行代谢工程改造等方法可以降低其成本。本论文利用三株海生杆菌(硝酸盐还原海生杆菌Marinobacterium.nitratireducens CGMCC 1.7286、居沉积物海生杆菌M.sediminicola CGMCC 1.7287和舟山海生杆菌M.zhoushanense CGMCC 1.15341)进行了不同碳源生产PHA的研究。硝酸盐还原海生杆菌和舟山海生杆菌可以利用糖类进行细胞生长和聚-3-羟基丁酸酯(poly-3-hydroxybutyrate,PHB)合成。相比之下,居沉积物海生杆菌对挥发性脂肪酸表现出良好的耐受性,利用10 g/L戊酸得到3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基戊酸(3HV)共聚酯[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate),PHBV],产量达到3.37 g/L,3HV单体含量为94.75 mol%,这是海生杆菌首次利用戊酸合成高含量3HV单体的报道。此外,该菌能将乙酸和丁酸的混合物转化为PHB,产量为4.78 g/L;将乙酸、丁酸和戊酸的混合物转化成PHBV,产量为5.06g/L,3HV单体含量为47.77 mol%。PHBV的热力学性能研究表明,与PHB相比,其结晶度降低,由刚性变为柔软的弹性材料,有利于材料的热加工。对居沉积物海生杆菌进行全基因组测序与分析,知晓其基因组大小约3.55 Mb,GC含量56.82%,共编码3162种蛋白。根据基因注释信息,发现居沉积物海生杆菌具有完整的挥发性脂肪酸代谢途径和PHA合成途径。此外,该菌具有部分芳香族化合物的降解途径,苯、苯酚和苯甲酸等物质通过中间代谢物邻苯二酚来进行降解。基因组测序数据分析为该菌在利用挥发性脂肪酸合成PHA和部分海洋芳香族污染物治理等领域的应用提供了理论基础。对居沉积物海生杆菌分别在人工海水培养基以及分别添加乙酸、丁酸和乙酸、丁酸、戊酸培养,并进行转录组测序,获得基因表达水平数据。乙酸、丁酸培养下的样本中下调基因大约是上调基因数目的4倍,而乙酸、丁酸、戊酸培养下的样本中上调基因大约是下调基因数目的1.5倍。对差异基因进行分析,筛选出表达效果显著上调的基因30个,下一步将筛选出在混合酸条件下高效转录的强启动子并利用其对居沉积物海生杆菌进行代谢工程改造,建立遗传操作方法,使其成为可以利用挥发性脂肪酸合成多种高附加值产物的工业底盘。
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