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全球每年约产生1010t–1011t畜禽粪便,而畜禽粪便中含有大量的病原微生物。若未经有效处理,就直接作为粪肥或土壤改良剂施入到农田,会导致土壤生物污染,进而引发人畜共患病的传播、感染及暴发。肠出血性大肠杆菌O157:H7是常见的人畜共患病原菌,因其感染剂量低(10个活细胞),并发症严重(溶血性尿毒症),而备受关注。该病原菌主要通过畜禽粪便进入土壤环境,可在土壤中存活1年以上,易感染环境中的动物;而感染的动物又会重新产生并释放病原菌,周而复始,导致恶性循环。此外,土壤中的大肠杆菌O157:H7可发生迁移,不仅会污染地表水和地下水,也会污染土壤中种植的蔬菜瓜果等农产品,严重威胁人类健康和公共安全。近30年来,全球共暴发上百次大肠杆菌O157:H7感染性腹泻事件。其中,免疫功能不全的儿童或老人备受威胁,感染病原菌后的死亡率可高达15%。因此,本文以大肠杆菌O157:H7和多种土壤组分(不同类型土壤、不同粒径土壤颗粒、粘土矿物)为材料,采用土壤化学和分子生物学方法,如土壤基本性质的表征,等温平衡粘附,细胞平板计数,结晶紫染色法,定量基因扩增荧光检测法等;借助扫描电子显微镜、原子力显微镜、荧光显微镜等现代分析仪器,探究大肠杆菌O157:H7与土壤组分的界面互作和存活机制,以阻控由病原菌引起的土壤生物污染。主要研究结果如下:(1)阐明了土壤理化性质和大肠杆菌O157:H7粘附行为的相关性及贡献程度。一元线性回归分析表明,大肠杆菌O157:H7的平衡分配系数(Kd)与土壤有机质的含量呈极显著负相关(P<0.01),而土壤pH、电导率、粘粒含量、比表面积、阳离子交换量(CEC)和Kd无显著相关(P>0.05)。偏相关分析排除其它因素的干扰,发现土壤有机质和粘粒共同控制大肠杆菌O157:H7的粘附行为(P<0.05)。通过多元逐步回归手段,得到Kd和土壤理化性质的相关性方程:Kd=-1.306×OM+0.536×CC+51.036(P<0.01),表明有机质是最重要的影响因素,对病原菌粘附的贡献率为66.95%,显著高于粘粒(33.05%)。因此,土壤有机质和粘粒等固相性质调控大肠杆菌O157:H7的粘附行为,最终影响病原菌在环境中的迁移和分布。(2)探明了土壤类型(红壤/棕壤),颗粒大小(砂粒、粉粒和粘粒),氧(氢氧)化铁/铝,有机质对大肠杆菌O157:H7在土壤环境中存活的影响机制。大肠杆菌O157:H7接种于棕壤颗粒中,3d内,病原菌的数量上升0.6 log10CFU/g–1.4 log10 CFU/g(除去有机质粘粒外)。而红壤颗粒中的大肠杆菌O157:H7数量快速下降,直到检测下线;初始6h的失活速率最高,病原菌的数量下降0.52log10 CFU/g–0.97 log10 CFU/g。去除氧(氢氧)化铁/铝后,红壤颗粒的杀菌性能降低,大肠杆菌O157:H7的存活能力显著提高。对两种土壤而言,大肠杆菌O157:H7均在含有机质粘粒中的存活能力最强。相比于砂粒和粉粒,粘粒对大肠杆菌O157:H7的吸附能力更强,对病原菌的乙酸代谢途径相关基因的影响更显著(pta上调6.1倍–9.3倍,ackA下调63.5%–91.7%)。pta上调和ackA下调会促进胞内乙酰磷酸的累积,加速细菌从游离态向生物被膜形态的转变。此外,粘粒更有助于大肠杆菌O157:H7保持生理活性。8d后,粘粒中病原菌的腺苷-5′-三磷酸(ATP)的含量(0.36×10-18 mol ATP/CFU–0.39×10-18 mol ATP/CFU)显著高于砂粒和粉粒中的病原菌ATP含量(0.13×10-18 mol ATP/CFU–0.21×10-18 mol ATP/CFU)。砂粒和粉粒去除有机质后,大肠杆菌O157:H7的生理活性未发生明显改变,且病原菌的存活时间显著提高,表明有机质的作用不是提供养分。而有机质的去除,会提高土壤颗粒对病原菌的吸附能力。因此,我们推测难溶性有机质的主要作用是遮蔽土壤颗粒的粘附位点,影响细菌-土壤颗粒的界面作用,阻碍细菌粘附表型的转变,最终影响病原菌的存活。上述结果表明,大肠杆菌O157:H7在土壤颗粒表面的粘附及其相关代谢途径是存活优势,帮助细菌在自然环境中的长期存活。(3)明确了典型土壤粘土矿物(蒙脱石、高岭石和针铁矿)对大肠杆菌O157:H7生长,生物被膜形成和毒性基因表达的影响机制。带负电的蒙脱石促进大肠杆菌O157:H7的生长,抑制生物被膜的形成;边面带正电的高岭石有利于病原菌的粘附,促进生物被膜的形成;带正电的针铁矿显著抑制病原菌的生长,促进生物被膜的形成。荧光显微镜照片显示,针铁矿能有效粘附并杀灭大肠杆菌O157:H7,而高岭石和蒙脱石均不影响病原菌的活性。原子力显微镜和扫描电子显微镜显示了大肠杆菌O157:H7和矿物多样的结合方式,蒙脱石疏散的分布在病原菌周围,未发生有效粘附,高岭石主要通过边面和病原菌发生粘附,而针铁矿紧密粘附在病原菌表面,形成矿物包被体。和空白对照相比(17.05±2.41nN),蒙脱石中形成的细菌生物被膜的粘性显著降低(10.38±1.29nN)(P<0.05),高岭石略为促进生物被膜的粘性(19.85±3.34nN),但不显著(P>0.05)。而针铁矿诱导形成高粘性的生物被膜(29.00±4.84nN),并且生物被膜中的细菌形貌发生显著变化:细胞变小、粗糙度增加且不规则。基因结果进一步证实大肠杆菌O157:H7生物被膜的形成机制。蒙脱石促进病原菌中编码鞭毛蛋白的基因-fliC的表达,增加细菌的游动性;下调编码菌毛蛋白的基因-csgA,阻碍细菌的不可逆粘附(生物被膜形成的初始阶段);下调荚膜异多糖(EPS重要组分)组分基因-wcaM,降低生物被膜的粘性,抑制生物被膜的形成和成熟。高岭石体系中,病原菌的fliC下调,而csgA上调,利于细菌在界面上的不可逆粘附;wcaM上调,会提高生物被膜的粘性,有利于生物被膜的形成。此外,pta上调和ackA下调,导致乙酰磷酸的积聚,进一步促进菌毛和荚膜异多糖的分泌,加速生物被膜的成熟。针铁矿不仅促进荚膜异多糖的调控基因(rcsA,rcsB和rcsC)和wcaM的表达,而且诱导病原菌群体密度感应信号分子(Autoinducer-2)的调控基因-luxS的表达,促进生物被膜的形成。生物被膜形成初期,矿物的存在,会抑制生物被膜的形成,生物被膜量显著低于纯菌体系,但毒性基因的表达(stxA-1和stxA-2)出现上调趋势。生物被膜形成后期,针铁矿和高岭石体系中病原菌的生物被膜量显著高于空白,而stxA-1和stxA-2的表达低于空白。因此,我们推测生物被膜形成和毒性表达可能是两个互相排斥的过程。粘土矿物的理化性质(电化学特性和形貌)是关键,决定矿物-病原菌的界面作用(结合方式和粘附强度),最终影响病原菌在土壤环境中的归趋。