牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是牛病毒性腹泻病（Bovine viral diarrhea,BVD）的病原体,属于黄病毒科的瘟病毒属。BVDV不仅感染牛、羊、猪,还感染鹿、骆驼等动物。真核细胞mRNA中,5’端非编码区（5’untranslated region,5’UTR）可与RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）一起调控mRNA的翻译;BVDV基因组中的5’UTR在病毒的转录、翻译过程中具有重要作用。但目前有关BVDV 5’UTR的研究较少,哪些蛋白可以和BVDV 5’UTR发生相互作用并且如何影响BVDV复制过程?尚不清楚,亟待研究阐明。本研究利用RNA-蛋白质相互作用检测（RNA-protein interaction detection,Ra PID）技术,筛选与BVDV 5’UTR互作的蛋白;si RNA敲低互作蛋白,探究互作蛋白对BVDV复制的影响,为进一步阐明BVDV感染的分子机制提供依据。1.BVDV 5’UTR基因的扩增以及真核表达载体的构建根据Gen Bank数据库中BVDV基因组序列,设计BVDV 5’UTR基因的扩增引物,PCR扩增BVDV 5’UTR基因。将扩增的BVDV 5’UTR基因克隆至RNA motif载体中,菌液PCR鉴定后进行测序分析。试验结果表明:成功扩增出BVDV 5’UTR基因,并将其插入到酶切后RNA motif载体中,成功构建RNA motif-BVDV 5’UTR真核表达载体,为进一步探究BVDV 5’UTR的功能奠定基础。2.Ra PID技术筛选与BVDV 5’UTR互作的蛋白将构建的RNA motif-BVDV 5’UTR的质粒和BASU质粒转染至HEK-293T细胞中包装慢病毒,收集慢病毒感染MDBK细胞后用嘌呤霉素和潮霉素B筛选阳性细胞;利用RT-PCR检测BVDV5’UTR在细胞系中是否稳定表达;用不同浓度的Biotin、不同时间处理上述细胞系,Western blot确定Biotin处理的最适浓度和时间;扩大培养RNA motif-BASU和RNA motif-BVDV 5’UTR-BASU细胞系并用已确定最佳浓度的Biotin处理,提取蛋白用Dynabeads?My One?Streptavidin T1磁珠亲和层析后进行蛋白质谱分析。试验结果表明:成功构建RNA motif-BASU和RNA motif-BVDV 5’UTR-BASU稳定表达细胞系;200μΜBiotin处理细胞18 h时效果最佳;将对照组RNA motif-BASU与实验组RNA motif-BVDV5’UTR-BASU的蛋白质谱结果进行对比分析,最后筛选出11种差异蛋白。3.BVDV 5’UTR互作蛋白的功能研究对筛选的差异蛋白进行生物信息学分析以及查阅相关研究文献,最终筛选出2个候选因子TRAF2和SNED1进行后续功能研究。设计si RNA敲低MDBK细胞中TRAF2和SNED1基因表达,RT-q PCR检测TRAF2和SNED1基因表达的情况;BVDV感染TRAF2和SNED1敲低细胞系不同时间后,RT-q PCR检测BVDV 5’UTR mRNA的水平;免疫荧光检测BVDV双链RNA（Double-stranded,ds RNA）的积累,在倒置显微镜观察BVDV致细胞病变（Cytopathic effect,CPE）情况,根据Kaber方法测定病毒滴度变化情况。试验结果表明:BVDV感染TRAF2和SNED1敲低细胞系后,显著性降低BVDV 5’UTR mRNA水平,细胞中绿色荧光标记的BVDV ds RNA积累减少,同时CPE现象减弱,子代病毒滴度降低。本研究成功构建出RNA motif-BVDV 5’UTR真核表达载体,利用Ra PID技术筛选获得与BVDV 5’UTR互作的蛋白,si RNA敲低TRAF2和SNED1基因显著性阻止BVDV复制,为探究BVDV感染机制提供理论依据。