【摘 要】
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乳腺生物反应器是将外源基因定位表达于哺乳动物乳腺中,通过转基因动物乳腺分泌乳汁生产重组蛋白。家兔乳腺生物反应器是美国FDA安全许可的表达平台,生产的人源医用蛋白已经上市。重组人凝血因子七（rh FⅦ）是治疗血液病、创伤性出血等疾病的有效药物,现今医疗中使用的rh FⅦ来自于幼仓鼠肾细胞重组表达,其生产成本高、产量尚不能满足需求。利用乳腺生物反应器表达rh FⅦ产量更高、成本更低。实现乳腺生物反应器
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乳腺生物反应器是将外源基因定位表达于哺乳动物乳腺中,通过转基因动物乳腺分泌乳汁生产重组蛋白。家兔乳腺生物反应器是美国FDA安全许可的表达平台,生产的人源医用蛋白已经上市。重组人凝血因子七（rh FⅦ）是治疗血液病、创伤性出血等疾病的有效药物,现今医疗中使用的rh FⅦ来自于幼仓鼠肾细胞重组表达,其生产成本高、产量尚不能满足需求。利用乳腺生物反应器表达rh FⅦ产量更高、成本更低。实现乳腺生物反应器高效表达重组蛋白,需要经过转基因动物繁殖选育,获得遗传稳定、表达稳定的新品系。在家兔选育中,掌握转基因在子代中传递及表达规律是选育优良转基因新品系的基础。本研究通过原核显微注射制备了rh FⅦ转基因兔,对原代兔进行繁殖建系;在建系过程中探究rh FⅦ基因在子代中的传递规律、rh FⅦ蛋白在子代中的表达规律及在泌乳周期中的表达规律。首先,本研究构建了乳腺特异性表达载体p BC1-rh FⅦ,经受精卵原核显微注射,制备了rh FⅦ转基因兔。我们挑选了两个rh FⅦ蛋白表达量较高的原代转基因兔A258和A266进行繁育建系,转基因兔已繁育至第5代。采用荧光定量PCR方法,分析转基因兔在繁育过程中rh FⅦ基因拷贝数的变化。实验发现,A258转基因兔系F2代至F5代转入基因拷贝数为2～8个拷贝;A266转基因兔系F3代转基因兔转入基因拷贝数为20～30个拷贝。采用Western Blot的方法,分析繁育过程中子代兔乳汁rh FⅦ蛋白的表达水平、子代在一个连续泌乳周期中rh FⅦ蛋白的表达水平。实验发现,转基因兔乳汁在50 KD左右有印迹条带,与预计相符。对转基因兔系A258不同代次转基因兔蛋白表达水平进行分析,结果显示:转基因兔A530（F1代）与B045（F2代）rh FⅦ蛋白表达水平差异极显著（P﹤0.01）;转基因兔A530（F1代）与A483（F1代）、B063（F2代）的rh FⅦ表达水平有显著差异（P﹤0.05）;转基因兔A530（F1代）与E40（F5代）的rh FⅦ表达水平差异不显著（P﹥0.05）。转基因兔E40（转基因兔系A258,F5代）去脂乳汁中rh FⅦ表达量为2.5～6.3 mg/m L,转基因兔E31（转基因兔系A266,F3代）去脂乳汁中rh FⅦ表达量为2.9～6.7 mg/m L。同时,转基因兔E40在同一泌乳周期中的第4天～第11天,乳汁中rh FⅦ表达水平无显著差异（P﹥0.05）;转基因兔E31在同一泌乳周期中的第2天～第10天,乳汁中rh FⅦ表达水平无显著差异（P﹥0.05）。结果表明:在转基因兔繁育过程中,不同转基因兔原代个体转基因的拷贝数有差异,且同一兔系同代转基因兔的拷贝数也略有差异,同一兔系随着代次的增加转基因拷贝数有下降趋势,在F5代基本趋于稳定;在rh FⅦ蛋白表达方面,同系各代次转基因兔蛋白表达水平不同,且无明显规律;转基因兔个体在主要泌乳期——泌乳早期和中期rh FⅦ蛋白表达水平无明显变化,不受乳蛋白组分变化影响。综合分析发现,rh FⅦ拷贝数与rh FⅦ蛋白表达水平之间无明显相关性。
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