血吸虫病是一种严重危害人类健康的传染性疾病,广泛流行于亚洲、非洲和拉丁美洲,被世界卫生组织列为被忽视的热带病之一(Neglected Tropical Diseases,NTD)。血吸虫病致病的中心环节是肝脏虫卵肉芽肿和继发的肝脏纤维化,其原因主要是由于T淋巴细胞细胞亚群分化和功能异常介导的免疫病理损伤,特别是CD4+T(Th)亚群在感染不同阶段改变介导了持续对虫卵抗原产生免疫应答所致病理改变,但确切的机制尚待探讨。已有研究表明,Th1/Th2免疫偏移与血吸虫病免疫病理损伤——虫卵肉芽肿的发生、发展及其免疫调节异常密切相关。Th17和Tfh是近年来备受关注的参与血吸虫感染免疫和病理进程相关的Th细胞亚群。因此,宿主感染血吸虫后诱发Th细胞亚群(Th1/Th2/Th17/Tfh)功能的失衡可能是血吸虫免疫病理机制的重要因素,值得进一步探讨。迄今对于T细胞免疫应答在血吸虫感染免疫应答的研究绝大多数集中于CD4+T细胞及其亚群,而对于CD8+T细胞研究甚少。有研究认为,CD8+T细胞在曼氏血吸虫感染宿主过程中可能具有抑制免疫病理的作用,但尚未有确切证据证实。因此,研究T细胞亚群在血吸虫病不同病理阶段的改变和介导的免疫应答类型,寻找调控T细胞亚群免疫失衡的靶点,对防治血吸虫病免疫病理损伤,研究和寻找新的免疫干预措施具有十分重要的意义。业已证明,T细胞的有效活化和功能介导需要双重信号的协同作用:一是抗原肽—MHC复合物,被T细胞抗原受体(TCR)识别;二是共刺激信号,由抗原提呈细胞(APC)和T细胞表面的共刺激分子配体和受体相互作用所介导。可诱导共刺激分子(Inducible costimulator mocule,ICOS)和程序性死亡受体1(Programmed death-1,PD-1)是介导T细胞有效激发、适度效应和适时中止的重要的正性和负性调控分子,共刺激分子与其配体(ICOS/ICOSL和PD-1/PD-L1)介导的信号对宿主调节免疫应答起重要作用,因而成为肿瘤免疫、感染免疫和自身免疫性疾病的研究热点。本课题以血吸虫感染小鼠为实验动物模型,以t细胞亚群为主线,探讨t细胞和相关免疫分子特别是正性共刺激分子icos/icosl和负性共刺激分子pd-1/pd-l1,在血吸虫感染以及再感染不同阶段的作用,研究其与血吸虫所致宿主免疫病理变化的相关性,并进一步观察对血吸虫感染模型进行icos/icosl和pd-1/pd-l1信号途径体内干预的研究,探讨正性共刺激信号icos和负性共刺激信号pd-1对血吸虫感染宿主关键的免疫病理损伤——虫卵肉芽肿反应的调控作用,为血吸虫病病理损伤的免疫干预提供新的思路。第一部分t细胞亚群和相关分子在血吸虫感染小鼠模型中的表达及与肝脏病理变化的相关性目的:观察血吸虫感染小鼠不同阶段t细胞亚群和th亚群(th1/th2/th17/tfh)以及相关分子的表达变化,平行性观察感染不同阶段血吸虫病肝脏病理变化。方法:balb/c小鼠以腹部贴片法建立血吸虫感染动物模型;采用多参数荧光标记流式细胞术检测血吸虫感染小鼠不同阶段t细胞亚群、th细胞亚群(th1/th2/th17/tfh)以及共刺激分子icos/icosl和pd-1/pd-l1的表达;应用荧光定量pcr的方法检测同期小鼠th亚群(th1/th2/th17/tfh)转录因子表达水平;采用免疫组化he染色观察血吸虫主要免疫病理损伤——肝脏虫卵肉芽肿的反应进程,分析其与t细胞亚群、th亚群(th1/th2/th17/tfh)以及共刺激分子icos/icosl、pd-1/pd-l1表达的相关性。结果:(1)小鼠肝脏免疫组化he染色,对不同阶段感染小鼠的肝脏虫卵肉芽肿面积的分析表明,血吸虫病感染后8w,宿主对于血吸虫免疫应答的虫卵肉芽肿反应最强。(2)流式细胞术分析结果显示,感染血吸虫后3w小鼠外周血和脾脏cd4+t细胞下降,cd8+t细胞升高,于感染第8w达最高值;(3)小鼠脾脏和淋巴结中tfh从感染3周即出现升高,而外周血tfh感染8w后升高。感染小鼠血清中特异性抗体水平igg与脾脏tfh细胞比例成正相关。(4)th1细胞因子ifn-γ于感染1w即升高,于第5w(虫卵形成期)出现下调,随后逐渐下降;th2型细胞因子il-4以及th17型细胞因子il-17均于感染6w后升高,并持续维持在较高水平;tfh型细胞因子il-21于感染3w出现升高,感染10w达到峰值,感染后期维持在较高水平;脾脏中th1/th2/th17/tfh特异性转录因子(tbet/roryt/gata3/bcl-6)动态变化与其相应细胞因子动态变化一致;(5)cd4+t细胞上共刺激分子icos和pd-1在血吸虫感染后表达上调;其配体在cd19+b细胞上调表达。结论:血吸虫感染引起宿主cd4+t细胞的降低和cd8+t细胞的升高;宿主t细胞免疫应答感染初期以th1应答为主,随着病程进入虫卵抗原产生至宿主肝脏虫卵肉芽肿的形成和发展,th2、th17、tfh免疫应答增强,t细胞表面共刺激分子pd-1和icos表达显著升高,其配体表达上调。本研究发现虫卵肉芽肿与cd8+t比例关系密切,特异性抗体水平igg与脾脏tfh细胞比例成正相关,值得进一步探讨。第二部分t细胞亚群和相关分子在血吸虫再感染小鼠模型的表达及与病理变化的相关性目的:分析宿主初次感染、再感染及化疗后体内t细胞亚群、th细胞亚群(th1/th2/th17/tfh)和共刺激分子表达水平的变化,探讨t细胞亚群、th细胞和共刺激分子icos和pd-1在血吸虫再感染宿主中免疫应答的特征,为寻找预防血吸虫再感染和抑制宿主免疫病理的干预措施奠定基础。方法:balb/c小鼠以腹部贴片法建立小鼠初次感染、再感染和治疗后的动物模型。采用流式细胞术观察血吸虫感染小鼠在再感染、初次感染及化疗后状态下体内t细胞亚群、th细胞亚群以及共刺激分子pd-1和icos的的表达水平;免疫组化方法观察感染小鼠的血吸虫虫卵肉芽肿的病理变化;探讨t细胞亚群、th细胞亚群及icos/icosl和pd-1/pd-l1与再感染状态下免疫病理变化的相关性。结果:(1)化疗组小鼠外周血和脾脏cd4+t比例较感染组小鼠升高,cd8+t比例较感染组小鼠降低,icos/icosl和pd-1/pd-l1的表达较感染组均下调,il-4、il-17均出现不同程度的降低,而ifn-γ无明显改变,由此表明化疗组小鼠的th2/th17/tfh型免疫反应均呈现下调的趋势;(2)再感染组小鼠外周血和脾脏中cd4+t比例较初次感染组比例升高,cd8+t比例降低,外周血icos和pd-1与初次感染组比较没有显著性差异,而脾脏cd4+t上icos和pd-1上调表达;再感染组与初次感染组比较ifn-γ和il-4未见显著性差异,而再感染组il-17和il-21型细胞因子较初次感染组低;(3)血吸虫再感染小鼠较初次感染小鼠的虫荷数减少,初次感染对于再感染宿主有19.9%的保护率;再感染组小鼠肝脏虫卵肉芽肿的面积与初次感染组无差别。结论:再感染宿主t细胞亚群以及th细胞亚群与初次感染时呈现出不同的特征,再感染宿主cd4+t比例较初次感染时升高,cd8+t比例虽仍高于正常对照组,但与初次感染相比出现下降,th17和tfh免疫应答反应较初次感染时下调,而外周血和脾脏cd4+t细胞共刺激分子pd-1和icos的表达较初次感染时上调,其配体表达与初次感染无明显差异。第三部分icos/icosl和pd-1/pd-l1信号体内干预及联合砒喹酮治疗对血吸虫感染小鼠作用及机制研究目的:观察icos/icosl和pd-1/pd-l1信号体内干预及联合砒喹酮治疗对血吸虫病免疫病理损伤的治疗作用,探讨pd-1/pd-l1信号激发联合砒喹酮治疗对减轻血吸虫病免疫病理损伤的可能作用机理,为血吸虫病肝脏病理损伤的免疫干预措施提供实验依据。方法:对balb/c小鼠的血吸虫感染模型在感染6w(虫卵肉芽肿形成期)时进行icos/icosl和pd-1/pd-l1信号的体内干预。血吸虫感染小鼠进行正性共刺激信号icos阻断(icos阻断性抗体,anti-icoslmab)或负性信号增强(pd-l1重组蛋白,pd-l1.fc)的干预措施,同时联合砒喹酮进行杀虫治疗,观察正性信号icos和负性信号pd-1干预对血吸虫病治疗作用和免疫病理损伤的影响;由于发现负性信号增强(pd-l1.fc)和吡喹酮联合干预能明显减轻和抑制肝脏病理损伤,因此进一步在小鼠感染血吸虫的不同阶段(感染3w、6w、12w),采用增强pd-1信号的pd-l1.fc和阻断pd-1信号的anti-pd-l1mab对pd-1/pd-l1信号激发或者阻断干预,采用流式细胞术分析观察干预后cd4+t、cd8+t、cd19+b细胞的变化以及病理形态分析,观察其对病理损伤的影响。结果:(1)正性信号抑制(anti-icoslmab)联合吡喹酮治疗小鼠肝脏肉芽肿面积与单独砒喹酮治疗组小鼠无显著性差异;(2)吡喹酮联合负性信号增强即pd-l1.fc干预组小鼠肝脏肉芽肿面积低于单独砒喹酮治疗组小鼠,由此表明pd-l1信号增强干预可显著减轻血吸虫感染小鼠虫卵肉芽肿的病理损伤;(3)在此基础上,对小鼠感染血吸虫不同阶段(3w、6w和12w)进行pd-1/pd-l1信号阻断(anti-pd-l1mab)的免疫干预,结果显示小鼠外周血、脾脏pd-1分子在cd4+t和cd8+t淋巴细胞表面表达下调、pdl-1分子在cd19+b细胞表达下调,在不同阶段负性阻断干预对血吸虫病肝脏病理没有显著影响,cd8+t细胞比例与感染组小鼠无显著性差异;(4)对小鼠感染血吸虫不同阶段(3w、6w和12w)进行pd-1/pd-l1信号增强的免疫干预,结果显示小鼠外周血、脾脏pd-1分子在cd4+t和cd8+t淋巴细胞表面表达上调、pdl-1分子在cd19+b细胞表达上调,在小鼠感染血吸虫3w和6w干预小鼠病理损伤减轻,pd-1/pd-l1信号增强的免疫干预组,cd8+t细胞比例明显下降,尤其是pd-1/pd-l1信号增强联合吡喹酮治疗组,小鼠病理损伤显著地减轻,并可杀灭成虫,同时cd8+t细胞比例低于单独干预组;而感染12w进行干预对小鼠肝脏病理没有明显作用。结论:正性信号阻断(anti-icoslmab)和负性信号阻断(anti-pd-l1mab)对血吸虫感染小鼠的免疫病理没有显著影响;而pd-1/pd-l1信号增强(pd-l1.fc)联合吡喹酮治疗,杀成虫的同时可明显减轻血吸虫感染小鼠虫卵肉芽肿的病理损伤,且cd8+t细胞明显下降。同时证实pd-l1早期干预联合吡喹酮治疗血吸虫病可显著减轻血吸虫感染引起的不可逆的肝脏病理损伤,有潜在的应用前景。本论文研究表明,感染血吸虫宿主的免疫应答过程中,t细胞亚群随着疾病病程进展过程而变化,呈现cd4+t细胞持续下降,cd8+t细胞升高的特征,尤其在虫卵肉芽肿反应最强的8w,cd8+t细胞也达到最高值;伴随着疾病从急性向慢性反应的转归,th细胞亚群的动态变化和调节呈现出与慢性感染性疾病一致的特征,即在感染初期诱导以th1为主的细胞免疫应答,感染后期th2/th17/tfh免疫应答增强并对宿主的免疫病理损伤起重要的调节作用;本研究首次发现pd-1/pd-l1信号的增强可明显减轻血吸虫病免疫病理损伤,且引起感染宿主体内cd8+t的降低,pd-l1.fc联合血吸虫化疗药物吡喹酮不仅可杀灭成虫,也显著改善血吸虫病免疫病理损伤。综上所述,本论文动态地分析了血吸虫感染小鼠模型t细胞亚群的变化规律,探讨了共刺激分子icos/icosl和pd-1/pd-l1在血吸虫病免疫病理的表达及其调节机制,发现pd-1/pd-l1信号的增强可明显减轻血吸虫病免疫病理损伤,提示血吸虫感染所致的肝脏虫卵肉芽肿,继而发展为肝脏纤维化病变,与过度的炎症损伤相关,而pd-1可有效地调控过度的炎症反应及产生的病理损伤。本研究提出了靶向共刺激信号pd-1/pd-l1联合吡喹酮化疗的干预措施,这不仅为血吸虫病免疫病理机制研究提出新的思路,而且为预防和治疗血吸虫病病理损害提供新的治疗方案。