本研究根据2005年从北京某牛场分离得到的一株牛肠道病毒2型（Bovine enterovirus type2，BEV-2）毒株序列，设计了一对特异性引物，采用RT-PCR方法，扩增牛肠道病毒2型包含VP1（840bp）蛋白基因片段的VP1+（1275bp）序列，扩增产物克隆到 pMD-T19。验证该序列为目的片段后，将其克隆到表达载体pET-32a。重组质粒转化至Rosetta，经IPTG诱导后，SDS-PAGE显示重组蛋白在大肠杆菌中高效表达。将重组蛋白作检测抗原包被酶标板，成功建立了检测牛肠道病毒2型抗体的间接ELISA方法，为下一步BEV-2单克隆抗体的制备打下了基础。　　将纯化的牛肠道病毒2型（BEV-2）VP1+重组蛋白接种BALB/c小鼠，取其脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0用PEG4000进行融合。通过对杂交瘤细胞培养上清进行筛选，最终获得2株稳定分泌抗BEV-2 VP1+蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株（1G1、5G6）。　　用制备的单克隆抗体包被酶标板，通过一系列的优化，建立了BEV-2双抗夹心ELISA检测方法。该方法检测BEV-2病毒量的最低限为100TCID50/0.1mL，与BVDV、IBRV、BLV等病毒无交叉。结果表明双抗夹心ELISA检测方法特异强、敏感性高，并且重复性好。本研究在国内首次制备了牛肠道病毒2型单克隆抗体，为进一步研究和开发快速诊断牛肠道病毒试剂盒奠定了基础。