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苜蓿(Medicago sativa L.)属豆科多年生草本,是世界上最重要的饲料作物,在苜蓿的生产实践中往往会遇到一些病原微生物的侵染而导致苜蓿病害,病害严重时造成苜蓿减产和毁灭性损伤,带来极大的生产和经济损失。将抗病基因导入苜蓿栽培品种中,可以在短期内直接地改良苜蓿的抗病性能。本论文以甘农1号杂花苜蓿和甘农3号紫花苜蓿为供试材料,研究了其再生过程中的若干影响因素,探讨并掌握了再生条件,确定了适合2种苜蓿植株再生的最佳培养基;同时利用农杆菌介导法将绿色荧光蛋白(GFP)基因标记的抗病基因-溶菌酶(Lyz)基因导入到2个品种的苜蓿中,系统地研究了基因转化条件,建立了适宜的转化体系,进一步通过荧光显微镜和PCR检测,证实Lyz-GFP双元基因已经成功转入2种苜蓿中。主要研究内容和结果如下:1.再生体系的建立。以甘农1号和甘农3号苜蓿为供试材料,进行了其愈伤组织诱导、分化及生根的研究。结果表明:下胚轴为甘农1号杂花苜蓿和甘农3号紫花苜蓿再生的最佳外植体;最适诱导培养基为MS+2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT+0.7 %琼脂+2.5 %蔗糖,诱导时间为30 d;最佳的芽分化培养基为MS+0.3 mg/L NAA+0.7 %琼脂+2.0 %蔗糖;最佳生根培养基为1/2MS+0.3 mg/L NAA+0.7 %琼脂+2.0 %蔗糖。甘农1号最佳愈伤组织诱导率和分化率分别为100%和28 %,而甘农3号的最佳愈伤组织诱导率和分化率分别为100 %和25 %。2.农杆菌介导的基因转化及转化体系的建立。以培养7～10 d的2个苜蓿品种的无菌苗下胚轴为外植体,以农杆菌菌株为介体,进行了Lyz-GFP双元基因的转化,获得了优化的基因转化体系:Kan的筛选浓度为75 mg/L,筛选方法为延迟选择;抑菌素选择Cef较好,浓度为300 mg/L;外植体预培养和共培养时间同为3 d;用于转化的侵染方式和时间为摇床上摇动10 min,适宜的菌液浓度为OD600=0.4～0.5。本研究最终得到4株甘农1号抗性苗和6株甘农3号抗性苗,其中2株甘农1号和4株甘农3号苜蓿有绿色荧光表达,转化率分别为50 %和67 %。3.转化愈伤组织的荧光检测和PCR鉴定。将获得的转化愈伤组织和植株进行了荧光检测和PCR扩增。经荧光检测,2株甘农1号和4株甘农3号苜蓿均有绿色荧光的表达。PCR鉴定结果显示,在甘农1号杂花苜蓿和甘农3号紫花苜蓿愈伤组织中均出现片段大小为750 bp的条带,双重检测结果证明外源基因Lyz-GFP已成功转入甘农1号杂花苜蓿和3号紫花苜蓿愈伤组织中。